Revista Eletrônica do Programa de Bolsas - Edição ZERO

Bolsista: Pedro Henrique Roque da Conceição
Orientador(a): BARBARA VIEIRA DO LAGO
Resumo: Apesar da existência de uma vacina eficiente, estima-se que de 2 bilhões de pessoas no mundo já tenham sido infectadas pelo vírus da hepatite B (HBV), e que existam cerca de 260 milhões de portadores crônicos. Essa infecção é responsável por aproximadamente um milhão de óbitos ao ano devido a quadros graves de cirrose e carcinoma hepatocelular (HCC). Baseado em uma divergência >7,5% no genoma completo, o HBV é classificado em 9 genótipos confirmados (A-I), e um putativo décimo genótipo (J). Estes são, por sua vez, subdivididos em subgenótipos com distribuição geográfica distintas, e diferentes impactos na progressão clínica e resposta ao tratamento. Atualmente, diversos fármacos são utilizados no tratamento da hepatite B crônica, no entanto, a eficiência da terapia esbarra em fatores como efeitos colaterais severos, seleção de vírus resistentes, e mesmo nos casos de sucesso, a cura completa ainda é alvo de controvérsias. O grande desafio reside no fato de que o DNA circular covalentemente fechado (cccDNA) viral, produzido após a entrada do vírus no hepatócito, não é afetado pelas drogas atualmente licenciadas. A molécula de cccDNA é um intermediário replicativo altamente estável, utilizado para a produção de novos vírus. Além disso, esse vírus tem a capacidade que de integrar seu DNA no genoma do hospedeiro, o que possibilita a reativação da infecção a qualquer momento da vida do paciente. O objetivo desse estudo é investigar diferenças na eficiência replicativa e expressão de proteínas entre os isolados do vírus da hepatite B de diferentes genótipos em cultura celular, para futuramente avaliarmos a suscetibilidade de cada genótipo ao silenciamento gênico, via RNA de interferência. Para tanto, 25 amostras de diferentes genótipos e subgenótipos do HBV circulantes no Brasil e no mundo foram selecionadas. Essas amostras terão o DNA do HBV extraído por kits comerciais e amplificado por Reação em Cadeia da Polimerase. Os genomas completos obtidos serão utilizados para clonagem molecular e produção do cccDNA para transfecção em cultura de células Huh7. As análises comparativas de eficiência replicativa entre os genótipos serão realizada através da quantificação do DNA do HBV em sobrenadante da cultura celular e análise da expressão de proteínas virais. Os resultados aqui obtidos serão uma etapa fundamental para se compreender a suscetibilidade ao silenciamento gênico dos diferentes genótipos do HBV, via RNAi.

Bolsista: Amanda Maria Lago de Castro Leal
Orientador(a): Claudia Ida Brodskyn de Assis
Resumo: A leishmaniose é uma doença negligenciada causada por protozoários intracelulares de diversas espécies do gênero Leishmania . Essa doença tropical afeta milhões de pessoas em cerca de 88 países, sendo responsável por aproximadamente 70 mil óbitos anualmente. A Leishmania amazonensis apresenta-se tipicamente através da forma difusa, que envolve a disseminação para órgãos internos. Além disso, pode causar a forma cutânea localizada e em poucos casos a forma visceral . A forma na qual a doença irá se manifestar está diretamente relacionada com a espécie infectante e com a resposta imunológica do hospedeiro, todavia algumas espécies podem causar mais de um tipo de manifestação clínica . Durante a resposta imunológica, um dos desafios que as células do sistema imunológico enfrentam durante condições inflamatórias é a necessidade de energia para maturar e produzir biomoléculas 3 . As células do sistema imunológico, incluindo os monócitos, possuem diferentes requerimentos metabólicos e são alvos importantes na infecção por Leishmania spp, . A resposta imune está intrinsecamente relacionada com a atividade metabólica e a compreensão dos processos relacionados à essa interação na patogênese da Leishmaniose precisa ser melhor compreendido. Alguns patógenos intracelulares são capazes de modular o metabolismo de células hospedeiras, constituindo um dos mecanismos de escape da resposte imune e assim favorecendo seu crescimento e persistência no organismo hospedeiro. Diante disso, o objetivo desse estudo é avaliar a influência da infecção por Leishmania amazonenis no perfil metabólico em monócitos humanos. Estudos realizados pelo nosso grupo mostrou que mediante a infecção de macrófagos murinos derivados de medula óssea com Leishmania spp., ocorria um aumento do metabolismo mitocondrial, com elevação dos níveis de glicólise e fosforilação oxidativa. No entanto, em experimentos preliminares com macrófagos derivados de monócitos de sangue periférico humano, foi observada uma resposta contrária, com um aumento da glicólise e diminuição da fosforilação oxidativa após a infecção. Diante desse dado, fica nítida a importância de se investigar se existem diferenças entre os perfis metabólicos causados pela infecção com Leishmania spp. em células imunes de camundongos e humanos. Para isso, monócitos humanos derivados do sangue periférico de doadores da instituição serão coletados e posteriormente infectados com as formas promastigotas de L. amazonensis na proporção de 10 parasitas para 1 monócito, após a infecção será realizada analises da taxa de glicólise e fosforilação oxidativa através da mensuração da taxa de acidificação extracelular e taxa de consumo de oxigênio dos monócitos infectados e controles, através do aparelho SEAHORSE XF96 Extracellular Flux Analyzer. A carga parasitária e a taxa de infecção serão avaliadas mediante o tratamento prévio de 1 hora antes da infecção dos monócitos com os inibidores da via glicolítica e da fosforilação oxidativa. Além disso, a funcionalidade das mitocôndrias será avaliada através de sondas para dosagem de espécies reativas de oxigênio Cellrox (Thermo Fisher Scientific). A hipótese deste trabalho é que a infecção por L. amazonensis leva a reprogramação metabólica dos monócitos, acompanhada do aumento da atividade mitocondrial. Assim, com este estudo, espera-se elucidar como a Leishmania spp interfere no metabolismo de monócitos humanos. Devido ao fato de que L. amazonensis e L. braziliensis causam distintos tipos de resposta imune nos hospedeiros vertebrados, nossa hipótese é que as alterações provocadas por essas duas espécies de Leishmania no perfil metabólico dos monócitos humanos são divergentes, levando ao aumento da fosforilação oxidativa e glicólise respectivamente. Assim, com este estudo, espera-se elucidar como a infecção por Leishmania spp interferi no metabolismo de monócitos humanos.

Bolsista: Laura de Azeredo Santos
Orientador(a): Marcio Sacramento de Oliveira
Resumo: A Chikungunya é uma doença viral transmitida aos humanos pelas picadas de mosquitos fêmeas infectados que causa febre e fortes dores nas articulações. A doença foi reconhecida pela primeira vez em 1952, durante um surto no sul da Tanzânia. Em 2016, havia um total de 349.936 casos suspeitos e 146.914 confirmados por laboratório notificados ao escritório regional da OPAS, representando metade da carga em comparação com o ano anterior. Os países que notificaram a maioria dos casos foram Brasil, Bolívia e Colômbia (com cerca de 300.000 casos suspeitos entre eles). Em 2017, o ECDC notificou um total de 10 países, com 548 casos de Chikungunya, dos quais 84% foram casos confirmados. O Paquistão enfrentou um surto persistente que começou no ano anterior e relatou 8.387 casos, enquanto a Índia sofreu com 62.000 casos. Nas Américas e no Caribe foram notificados 185 mil casos; os casos no Brasil representaram mais de 90% dos casos na região das Américas. Surtos de Chikungunya também foram relatados no Sudão (2018), Iêmen (2019) e, mais recentemente, no Camboja e Chade (2020). Diante deste cenário de possibilidades de novas epidemias por Chikungunya, sobretudo no Brasil, devido ao cenário de crise econômica que o país passa nos últimos anos e a atual crise sanitária afetando os investimentos em PD&I, definir prioridades de investimento e priorizar políticas realmente efetivas, se faz necessária a realização de estudos prospectivos direcionados a atender demandas específicas. O projeto tem por objetivo realizar uma análise aprofundada da quantidade e qualidade da produção científica e tecnologica global sobre a Chikungunya. A metodologia consite na recuperação de registros em chikungunya nas bases Web of Science e Scopus para produção científica e no Orbit Intelligence para produção tecnológica, no período de 2010 a 2020. Através das técnicas de text e data mining será desenvolvida uma base de dados organizada e estruturada para a realização de análise bibliométrica. Serão utilizados os softwares Vantagepoint ® e VOSviewer para as etapas de tratamento e de análise dos dados.

Bolsista: VICTORIA DA SILVA MOREIRA
Orientador(a): Geraldo Rodrigues Sartori
Resumo: Justificativa O câncer está entre as principais causas de morte no Brasil, atrás somente de doenças cardiovasculares e respiratórias. Têm sido aprovadas por órgãos de regulamentação anticorpos monoclonais contra a doença, que representam um avanço em seu tratamento. Dentre os alvos terapêuticos, destaca-se a via da PD-1, sendo aprovados pela ANVISA, cinco anticorpos monoclonais, como o Pembrolizumab que foi incluído como estratégico para o SUS em 2017, e será produzido na plataforma vegetal de Biomanguinhos. Também nos últimos 5 anos foram depositadas no Protein Data Bank (PDB) a estrutura tridimensional de 22 complexos das proteínas PD-1 e PD-L1 com seus respectivos anticorpos. Tal informação, e a descrição do espaço conformacional das proteínas, realizada por nosso grupo, é de extrema importância para o planejamento de novas gerações de imunomoduladores contra esses alvos. A PD-L1 já é estudada em nosso grupo de pesquisa por meio de colaboração com pesquisadores da Fiocruz-RJ para o desenvolvimento de anticorpos biespecíficos. Além disso, nosso projeto se integra na plataforma de Anticorpos na Fiocruz-CE, (plataformas da Vice-Presidência de Inovação em Saúde), assim como no projeto Universal Faixa A-2018. O fortalecimento da linha de pesquisa em pré-desenvolvimento de anticorpos será de grande valia para a instituição e para a saúde pública do país. Frente a esse panorama, o subprojeto atual busca propor um novo anticorpo que se ligue a uma conformação específica da PD-L1 descrita no grupo, por meio de ferramentas computacionais e protocolos de simulação de dinâmica molecular estabelecidos no grupo. Esse anticorpo proposto possibilitará uma nova linha de desenvolvimento dessas macromoléculas, que podem vir a ser uma valiosa terapia contra alguns tipos de câncer. Atualmente, a bolsista tem realizado a validação do método de predição de estrutura quaternária, assim como buscando pelo melhor molde estrutural de anticorpo para otimização de afinidade em relação à PD-L1. A evolução natural do trabalho é avaliar a estabilidade do anticorpo mutado em relação à pose proposta originalmente, e realizar sucessivas etapas de otimização da afinidade predita do anticorpo pela PD-L1. Objetivos Propor um anticorpo específico a conformação da PD-L1 identificada pelo grupo que não se liga à PD-1. Especificamente, propomos: 1- Otimizar recursivamente a interação anticorpo-PDL1 já encontrada; 2- Desfavorecer a interação anticorpo-antígeno original; 3- Verificar a estabilidade dinâmica do complexo PDL1-anticorpo proposto. Metodologia A partir do anticorpo a ser obtido durante a vigência da primeira bolsa, será feita a otimização recursiva da interação AC-AG. Para isso, serão feitos diversos ciclos de mutação concatenados com simulações de dinâmica molecular aquecida para verificar a estabilidade da interação. Na etapa de mutação, servidores de Alanine scanning e mutagênese, (BeatMusic e mmCSM-AB), serão utilizados para propor mutações no AC, de forma a tornar a interação seletiva para a PD-L1, em detrimento ao AG original. Já para a etapa de verificação da manutenção da interação exercida pela mutação proposta, simulações de dinâmica molecular (DM) curtas, de até 5 ns , utilizando a versão em GPUs do software AMBER. A cada cinco rodadas de otimização de sucesso, serão feitas simulações sequenciais a temperatura constante de 310, 330, 360 e 390 K para verificar a estabilidade da interface AG-AC. O ciclo se repetirá até que se encontre um AC com RMSD de interface final abaixo de 5 A. Neste ponto, este estaria otimizado ao alvo. Cronograma Revisão Bibliográfica 1º a 9º mês Validação do modelo de docking 1º a 4º mês Seleção do anticorpo base 4º a 7º mês Proposição de mutações 7º a 9 mês Relatório e RAIC 9º mês Referência https://www.inca.gov.br/noticias/brasil-tera-625-mil-novos-casos-de-cancer-cada-ano-do-trienio-2020-2022 Nature, v. 541, n. 7637, p. 321–330, 2017. Sci. Transl. Med., v. 8, n. 328, 2016 Brief. Bioinf., v. 21, n. 5, 1549–1567, 2020

Bolsista: Caio Samuel de Oliveira
Orientador(a): MONICK LINDENMEYER GUIMARAES
Resumo: Apesar dos esforços da comunidade científica na busca da cura da aids, esta só foi alcançada duas vezes. O vírus persiste primariamente com genoma latente em células T CD4+ de longa memória e em nível menor em células T CD4+ naive fazendo estas, parte do reservatório viral o qual é mantido devido a expansão clonal das células e por vírus replicantes, principalmente em tecidos linfoides em que a cART não tem alcance. A cura funcional da infecção pelo HIV mais estudada é o início precoce da cART durante a infecção aguda pelo HIV. Esta parece ser a mais eficiente na redução do tamanho e complexidade do reservatório proviral associado às células mononucleares do sangue periférico, preservando a imunidade de mucosas e, ainda limitando a depleção de linfócitos T do trato gastrointestinal e a semeadura do reservatório do HIV, no entanto, esta não erradica o vírus. Alguns trabalhos evidenciam a remissão do HIV em indivíduos denominados controladores pós-tratamento, que apresentaram controle imunovirológico durante um período após interrupção da cART iniciada durante a infecção primária. A frequência de detecção deste fenômeno é baixa e incerta, no entanto, estudos vêm evidenciando que esta característica vem sendo obtida em maior frequência em indivíduos que iniciam a terapia precocemente quanto comparados aqueles que iniciam na fase crônica da infecção pelo HIV. E o tamanho dos reservatórios do HIV parece ser crucial para o controle bem-sucedido da replicação viral após suspensão da terapia. Diante deste fato, consideramos estratégico o estabelecimento da primeira coorte nacional de indivíduos diagnosticados e tratados na fase primária da infecção e seu acompanhamento. Assim, o presente projeto visa avaliar o impacto da cART iniciada na fase crônica recente da infecção pelo HIV-1 na diversidade do reservatório viral. Foram incluídos 82 indivíduos no estudo, sendo 32 indivíduos com infecção aguda pelo HIV-1 (Fiebig II-V), 31 indivíduos com infecção crônica recente pelo HIV-1 (Fiebig VI), e os demais ainda sem classificação de Fiebig. Destes, avaliaremos os reservatórios de células mononucleares do sangue periférico de dez indivíduos crônicos recentes nas visitas D0 (inclusão no estudo e início da cART) e M12 (meses após início da cART). As quasispecies de HIV-1 serão obtidas por diluição limite do DNA, seguida de nested PCR com da região de C2-V3 do gene env. Será considerando uma distribuição de Poisson, onde aproximadamente 30% dos amplicons são positivos, para que uma única molécula seja amplificada em cerca de 80% do tempo. Realizaremos aproximadamente 100 amplificações por indivíduo/visita para obtermos aproximadamente 10 clones por amostra/por visita. As sequências serão montadas e editadas usando o software SeqMan 7.0. As árvores filogenéticas de máxima verossimilhança serão reconstruídas com o programa PhyML 3.0. A complexidade da população viral intra-hospedeiro será avaliada através de duas medidas de diversidade, a diversidade média de nucleotídeos e a entropia de Shannon normalizada. O tropismo viral da quasispécie será previsto com base na sequência de aminoácidos da região V3 através do algoritmo Geno2pheno (disponível em http://coreceptor.geno2pheno.org) com taxa corte com taxa de falsos positivos (FPR) de 10% para classificação de sequências em vírus CCR5 ou não-CCR5 trópicos. As sequências do gene Pol (Protease/Transcriptase reversa) foram obtidas na entrada das amostras biológicas desses indivíduos no projeto visando a verificação de mutações de resistência aos antirretrovirais. Dos 84 indivíduos inclusos no projeto, para 11 não foi realizado o PCR e sequenciamento, sendo possível realizar a amplificação e sequenciamento de 73 indivíduos para essa região. Diante da disponibilidade dessas sequências no laboratório, foi realizada a análise filogenética e, dessa análise, 33 sequências foram classificadas como subtipo B (45%), 2 classificadas como subtipo D (2%), 3 como subtipo F1 (4%), 1 como subtipo A1 (1%) e 11 como subtipo C (15%). Para as demais 18 sequências estamos realizando a análise filogenética com sequências representativas dos CRFs BC e BF circulantes no Brasil assim como a análise de bootscan para verificar se alguma apresenta perfil igual à dos CRFs ou se essas serão classificadas como URFs. Tendo em vista a epidemiologia molecular do HIV no estado do Rio de Janeiro, foram detectados os subtipos majoritários B, C e F1, porém estes não se encaixaram na proporção normalmente detectados em estudos anteriores de epidemiologia, já que o subtipo B possui uma proporção maior (aproximadamente 80%) que a encontrada no presente estudo e o subtipo C (aproximadamente 5%) que apresenta uma proporção menor que a detectada.

Bolsista: SORAYA DE OLIVEIRA DA SILVA SANTOS
Orientador(a): THADEU ESTEVAM MOREIRA MARAMALDO COSTA
Resumo: A senescência celular é um fenômeno fisiológico associado ao envelhecimento caracterizado pela suspensão da proliferação celular. As células senescentes apresentam como características como: aumento de tamanho, da expressão da enzima beta-galactosidase e das proteínas p21 e p53 (envolvidas na regulação do ciclo celular), além de um perfil secretório caracterizado pela liberação de mediadores pró-inflamatórios como IL-6, IP-10, CCL2 e VEGF. A permanência de células senescentes no organismo por longos períodos contribui para o estabelecimento de uma inflamação crônica “estéril”, condição responsável pelo desenvolvimento de doenças associadas ao envelhecimento e de tumores. Assim, a descoberta e/ou desenvolvimento de substâncias que tenham como alvo as células senescentes podem ter um importante papel na prevenção e no tratamento de doenças associadas ao envelhecimento, promovendo um aumento na saúde e longevidade. A proteína do choque térmico 90, HSP90 é uma chaperona molecular responsável pela estabilidade de muitas proteínas celulares, incluindo as envolvidas no processo de senescência. Por este motivo, vem sendo apontada como um possível alvo para a eliminação de células senescentes. De fato, estudos recentes já demonstraram que a inibição da HSP90 foi capaz de aumentar o tempo de vida de C. elegans e retardou o início de fenótipos associados ao envelhecimento em fibroblastos e camundongos deficientes na enzima de reparo de DNA ERCC1 (Ercc1-/-). Desta forma, considerando a participação da HSP90 no processo de senescência e os efeitos cumulativos desta sobre o surgimento de doenças crônicas degenerativas associadas ao envelhecimento, a caracterização da atividade da HSP90 na senescência utilizando inibidores farmacológicos é de extrema importância.