Revista Eletrônica do Programa de Bolsas - Edição ZERO

Bolsista: Sabrina Soares Silva
Orientador(a): Osvaldo Pompilio de Melo Neto
Coorientador(a): Hemilly Rayanne F. da Silva
Resumo: Justificativa e relevância A leishmaniose tegumentar (LTA) é uma infecção mucocutânea caracterizada como doença negligenciada, responsável por mais de 90% dos casos de leishmaniose no Brasil [1]. O diagnóstico precoce é uma das formas de contenção da doença [2]. O diagnóstico parasitológico da LTA é considerado padrão ouro e envolve a detecção de formas intracelulares em amostras de raspagens, aspirados e impressão de fragmentos de lesões por coloração em lâminas fixadas. Este é um método invasivo e de precisão instável, dependente de fatores como período de infecção, qualidade de coleta das amostras e experiência do técnico responsável, apresentando ainda sensibilidade insatisfatória, de 43 a 70% [3]. Proteínas recombinantes, têm sido aplicadas ao melhoramento de testes sorológicos como alternativa aos testes utilizados, normalmente aplicados a ensaios de ELISA e têm demonstrado maior sensibilidade (95-100%) em relação a antígenos solúveis de Leishmania, que apresentam variações de sensibilidade de 1 - 97% [4]. Uma alternativa é o desenvolvimento de um teste sorológico baseado em proteínas quiméricas recombinantes, fáceis de incorporar e de baixo custo, a partir da seleção de epítopos. Para Leishmaniose Visceral, uma proteína quimérica (Q5) utilizada na plataforma de ELISA apresentou sensibilidade alta (82%) para soros de humanos, tornando a estratégia de genes quiméricos uma alternativa eficaz para diagnostico [5]. O uso de antígenos recombinantes tem mostrado estabilização na precisão dos resultados em testes imunoenzimáticos para LTA, além disso simplificam processos de obtenção e padronização. Logo, o projeto busca a identificação e utilização de epítopos alvos para criação de proteína quimérica e sua utilização em teste rápido. Objetivos 1 Pesquisar proteínas recombinantes na literatura para elaboração de proteína quimérica rica em peptídeos para células B; 2 Identificar antígenos a partir do extrato bruto de L. braziliensis; 3 Produzir antígenos recombinantes e quiméricos; 4 Avaliar a eficiência no diagnóstico sorológico; Metodologia Será feita a pesquisa na literatura de proteínas recombinantes com sensibilidade e especificidade alta (>90%) para soros de pacientes com LTA, que serão submetidas a análises de predição através de bioinformática, visando identificar possíveis peptídeos antigênicos para formação de uma proteína quimérica. Após a construção dos genes quiméricos eles serão enviados para síntese química comercial. Em seguida, os genes serão subclonados em vetores de expressão (pRSETa e/ou pGEX-TEV) para produção das proteínas quiméricas, onde vão ser avaliados as melhores condições de expressas dessas proteínas. As melhores proteínas expressas serão purificadas por cromatografia de afinidade e avaliadas por ensaios de Western-Blot com soros de pacientes com LTA. As proteínas que tiverem o melhor reconhecimento com os soros de pacientes serão sensibilizadas em placas de 96 poços e avaliadas por ELISA para verificação da sensibilidade e especificidade das proteínas quiméricas. Referências [1] VASCONCELOS, Jairla Maria et al. Revista Brasileira de Análises Clínicas, [S.L.], v. 50, n. 3, p. 221-227, nov. 2018. Revista Brasileira de Análises Clínicas [2] Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância em Saúde. Manual de vigilância da leishmaniose tegumentar. Brasília: Ministério da Saúde; 2017 [3] BRITO, Rory Cristiane Fortes de et al. Applied Microbiology And Biotechnology, [S.L.], v. 104, n. 19, p. 8105-8116, 26 ago. 2020. Springer Science and Business Media LLC. [4] ZANETTI, A. S. et al. Revista do Instituto de Medicina Tropical de Sao Paulo, v. 61, p. 1-11, 2019. [5] SANTOS, Wagner J. T. et al. Plos Neglected Tropical Diseases, [S.L.], v. 14, n. 7, p. 1-21, 27 jul. 2020. Public Library of Science

Bolsista: JULIANA OLIVEIRA DA MATA
Orientador(a): EDWARD JOSE DE OLIVEIRA
Coorientador(a): Não informado
Resumo: A esquistossomose intestinal, causada pelo Schistosoma mansoni, é uma doença parasitária considerada um problema de saúde pública no Brasil. O diagnóstico laboratorial dessa doença é realizado pela detecção de ovos do parasito nas fezes, utilizando método parasitológico. A técnica de Kato-Katz é a mais usada no Programa de Controle da Esquistossomose. Entretanto, essa técnica apresenta baixa sensibilidade quando aplicada para diagnóstico de indivíduos residentes em áreas de baixa prevalência. Visando contribuir para melhorar o diagnóstico laboratorial dessa doença, este projeto de pesquisa tem como propósito avaliar os ensaios de PCR-ELISA e PCR em tempo real (qPCR) para o diagnóstico da esquistossomose intestinal. Para isso, amostras de fezes coletadas de indivíduos residentes nos municípios de Malacacheta e Conde, consideradas como áreas de moderada endemicidade, serão examinadas pela técnica de Kato-Katz. Em seguida, amostras de fezes e urina serão examinadas pelos ensaios de PCR-ELISA e qPCR. O DNA total será extraído de 500 mg de fezes usando o kit comercial Power Fecal Pro (Qiagen GmbH, Hilden, Germany), de acordo com as recomendações do fabricante. O PCR-ELISA e o qPCR serão realizados de acordo com protocolo estabelecido pelo nosso grupo de pesquisa. Do município de Malacacheta, 400 foram efetivamente incluídos no estudo. Vinte e duas amostras foram positivas pela técnica de Kato-Katz, examinando-se duas lâminas, resultando em positividade de 5,5% (3,4-8,3). Considerando o ponto de corte de 0,150, 66/400 amostras de fezes foram positivas, que correspondem a 16,5% (12,8-21%) pelo PCR-ELISA. Infelizmente, não foi possível analisar as amostras de urina por meio do ensaio de PCR-ELISA em razão de queda da estabilidade dos reagentes, mesmo armazenados em congelador -20 ºC. Portanto as amostras de urina dos participantes de Malacacheta foram analisadas por meio do PCR convencional. Das 400 amostras de urina submetidas ao PCR convencional, 24 (6%, IC95%:3,84-8,93) foram positivas para a presença de DNA de S. mansoni. Os resultados do PCR em tempo real (qPCR) foram interpretados considerando um ponto de corte de 42 Ct. Dessa forma, a positividade do qPCR foi de 16,75% (IC95%:12,98-21,27), que foi muito parecida com a obtida pelo PCR-ELISA aplicado em amostras de fezes. Por outro lado, o qPCR, em DNA extraido de amostras de urina, apresentou uma positividade de 4,5% (IC95%:2,67-7,11), considerando um ponto de corte também de 42 Ct. Da população do município de Conde, já foi extraído DNA de 60 amostras de fezes, sendo que apenas uma apresentou concentração abaixo da média e, se não apresentar amplificação do controle interno, a extração e o ensaio de qPCR serão repetidos. A sensibilidade, especificidade, acurácia diagnóstica, concordância, razão de verossimilhança positiva e negativa dos ensaios de PCR-ELISA e qPCR serão determinadas, tomando como referência os resultados do exame parasitológico de fezes. O desenvolvimento desse projeto produzirá evidências técnico-científicas para embasar decisões no Programa de Controle da Esquistossomose.

Bolsista: JULIA SANTOS BOECHAT
Orientador(a): SIMONE SACRAMENTO VALVERDE
Coorientador(a): Não informado
Resumo: Plantas da família Asteraceae consideradas “arnicas brasileiras”, são espécies que apresentam vasto emprego popular e oficinal, sendo investigadas cientificamente quanto às suas atividades biológicas e farmacológicas relacionadas aos seus marcadores químicos sesqui e diterpenoides e/ou flavonoides. A definição “arnica” considera principalmente a ação dessas plantas medicinais como vulnerárias, no tratamento de contusões e feridas, como acontece com essas espécies utilizadas como sucedâneas da Arnica montana: Solidago chilensis Meyen (arnica do campo); Pseudobrickellia brasiliensis (Spreng.) R.M. King & H.Rob. (arnica do mato), Acmela brasiliensis. (Wedelia paludosa, Sphagneticola trilobata) (pseudo-arnica, arnica do mato), Calea uniflora Less (arnica da praia), Chaptalia nutans (L.) Polák (arnica do campo), Porophyllum ruderale (Jacq.) Cass. (arnica paulista), Lychnophora pinaster Mart., Lychnophora ericoides Mart. e Lychnophora salicifolia Mart. (arnicas). Este subprojeto visa, nesta primeira etapa, observar a ocorrência de solidagenona no extrato de rizomas, comparar os perfis químicos de rizomas e inflorescências de SCM, objetivando serem os rizomas, mais uma fonte do principal IFAV utilizado no projeto do orientador, o diterpeno solidagenona. Entretanto, ao considerarmos o ciclo de vida de Solidago chilensis - espécie bianual que, após seu ciclo de vida, que em época de reprodução vegetal, apresenta o brotamento dos ramos e, quando completado o ciclo, a parte aérea seca e desaparece, tendo que ser substituída por novas mudas, para a manutenção do seu cultivo (Figura 3). Ocorre em seguida, o descarte dos seus rizomas. Portanto, solicitamos os rizomas dessas plantas “senis” para prospecção química e comparação de perfil, visando a obtenção da solidagenona. Essa espécie é produzida em cultivo dedicado na Fiocruz, na Plataforma Agroecológica de Fitomedicamentos (PAF) e no Fórum Itaboraí (FIT). Essas espécies estão inseridas em projeto desenvolvido pelo PIT/Fiocruz (Projeto de Arranjo Produtivo Local de plantas medicinais – APL / Petrópolis) no qual, famílias residentes no quilombo do Tapera recebem assistência técnica para o cultivo de espécies vegetais de interesse medicinal, como a SC para melhorar as condições de vida e saúde dos habitantes e promover sua sustentabilidade socioambiental (FIT, 2014). Para isso, serão utilizadas técnicas de análise cromatográfica, espectroscópica e espectrométrica comumente utilizadas em química de produtos naturais, para garantir as etapas biológicas do projeto no qual este subprojeto encontra-se inserido.

Bolsista: Cristopher Bryan Silva Gomes
Orientador(a): CAROLINE FURTADO JUNQUEIRA
Coorientador(a): LUNA BARROCO DE LACERDA
Resumo: A malária está entre as doenças parasitárias mais letais do mundo e esforços vem sendo empregados para o combate e controle desta. Dentre as estratégias recomendadas pela Organização Mundial de Saúde, encontram-se o fortalecimento dos sistemas de vigilância epidemiológica e diagnóstico, como complementos à busca por uma vacina eficaz, controle vetorial e tratamento adequado. Em conformidade com o exposto, nosso grupo de pesquisa elucidou um mecanismo imunológico desencadeado pela infecção com Plasmodium vivax, no qual foi observado que reticulócitos infectados com esse parasito são capazes de apresentar antígenos via HLA de classe I e através de uma imunopeptidômica foi possível caracterizar os antígenos ligados. Estes foram estudados e selecionados para um proposto teste diagnóstico em plataforma baseada em reações imunoenzimáticas de quimiluminescência, CLEIA (do inglês, Chemiluminescence enzyme immunoassay). Nesse contexto, o presente projeto tem como objetivo prototipar e padronizar uma plataforma diagnóstica com base nos princípios da quimiluminescência para os antígenos selecionados contra a malária, dando continuidade aos estudos previamente desenvolvidos e complementando os projetos de pesquisa do nosso laboratório.

Bolsista: Theo Leoneli Pires
Orientador(a): CLAUDIA REGINA BRANDAO GOMES
Coorientador(a): VICTOR FACCHINETTI LUZ
Resumo: A tuberculose (TB) é uma doença causada pelo Mycobacterium tuberculosis, e representa um grave problema de saúde pública, apesar da existência de um esquema terapêutico que, na maioria dos casos, leva a cura. De acordo com dados da Organização Mundial de Saúde (OMS), cerca de um terço da população mundial é portadora assintomática do M. tuberculosis, e a estimativa é que em 2019, cerca de 10 milhões de novos casos de TB ocorreram em todo o mundo e, aproximadamente 1,2 milhões de pessoas morreram da doença. No mesmo ano, a estimativa é que meio milhão de pessoas desenvolveram tuberculose resistente a rifampicina, dentre elas, 78% tinham tuberculose multirresistente. No Brasil, segundo dados oficiais do Ministério da Saúde, em 2019 foram notificados 66.819 novos casos de TB (incidência de 31,6/100 mil habitantes). Neste ano, foram notificados cerca de 4,5 mil óbitos pela doença, com um coeficiente de mortalidade de 2,2 óbitos por 100 mil habitantes. Diante deste panorama, torna-se urgente o desenvolvimento de novas substâncias potencialmente ativas, capazes de apresentar maior eficácia e baixa resistência. Dentre as moléculas propostas para a síntese de novas substâncias com potencial atividade antituberculose pode-se destacar os derivados quinolínicos. Vários derivados quinolínicos tem sido reportado na literatura com atividade antituberculose, podendo-se destacar a bedaquilina, um derivado diarilquinolínico, que foi aprovado em 2012 pelo FDA, e em 2019 pela ANVISA. A bedaquilina é eficaz no tratamento de pacientes com infecção pulmonar por Mycobacterium tuberculosis multirresistente e extensivamente resistente a múltiplos fármacos. Neste contexto, o nosso grupo vem trabalhando com a síntese de várias substâncias desta classe, sendo o objetivo deste trabalho a síntese e o aumento de escala de building-blocks que possibilitem a obtenção de uma biblioteca de substâncias derivadas do núcleo 7-cloroquinolina, com múltiplos padrões de substituição na posição C-6, e funcionalizados na posição C-4 com as porções etilenodiamina, hidrazina e etanolamina.

Bolsista: BRENDA HEVILLIN ROCHA SIMTOB
Orientador(a): VLADIMIR FAZITO DO VALE
Coorientador(a): Não informado
Resumo: 1. Justificativa e relevância Cimex lectularius (Heteroptera: Cimicidae) é um ectoparasito intimamente associado com os seres humanos que se alimenta de sangue em todos os estágios de seu desenvolvimento (Usinger, 1966). Durante a hematofagia esses percevejos podem gerar intensas reações alérgicas em seus hospedeiros (Doggett et al., 2012). A saliva de artrópodes hematófagos é composta por inúmeras moléculas biologicamente ativas que facilitam a alimentação no hospedeiro vertebrado e comumente modulam a resposta imunológica no local da picada (Andrade et al., 2005). Inibidores do sistema do complemento têm sido universalmente encontrados na saliva e intestino de artrópodes hematófagos e a presença dessa atividade em inúmeras espécies filogeneticamente distantes indica um papel fundamental dessas moléculas para a sobrevivência e desenvolvimento desses artrópodes (Schroeder et al., 2009). De fato, a proteção conferida por inibidores do sistema do complemento já foi mostrada em algumas espécies de insetos hematófagos (Barros et al., 2009). Como parte da imunidade inata, o sistema do complemento é composto por cerca de 30 proteínas plasmáticas que interagem entre si para formar uma cascata de reações bioquímicas. Três vias principais ativam o sistema do complemento: (1) a via clássica, normalmente dependente de anticorpos; (2) a via alternativa, ativada de forma espontânea e (3) a via das lectinas, que reconhece determinados açúcares encontrados na superfície de patógenos (Merle et al., 2015). A ativação do sistema do complemento é capaz de opsonizar patógenos (facilitando assim a fagocitose), produzir peptídeos pró-inflamatórios e até mesmo lisar células invasoras através da formação de poros na membrana celular (Merle et al., 2015). Apesar da crescente preocupação com os percevejos de cama, até o momento a interação entre C. lectularius e o complemento humano não foi descrita na literatura científica. Tendo em vista a importância de mecanismos inibidores do sistema do complemento para a sobrevivência e desenvolvimento de artrópodes hematófagos (Barros et al., 2009) e a possibilidade de se utilizar o conhecimento gerado como base para uma nova metodologia de controle, nos propusemos estudar essa interação. 2. Objetivos Específicos - Avaliar o status de ativação do sistema do complemento no sangue ingerido; - Testar a atividade inibidora do sistema do complemento humano pela saliva e conteúdo intestinal de C. lectularius; - Determinar o ponto de inibição da cascata do complemento pelo(s) inibidor(es) solúveis; - Verificar a capacidade do epitélio intestinal de C. lectularius em inibir o complemento através da ligação de moléculas reguladoras presentes no plasma sanguíneo. 3. Metodologia 3.1 Manutenção dos insetos e obtenção das amostras biológicas Serão utilizados machos de C. lectularius em jejum por 20 dias provenientes da colônia mantida no insetário do Grupo de Pesquisa em Triatomíneos do IRR/Fiocruz. Esses insetos são mantidos em potes de plásticos, sob temperatura e umidade controladas e alimentados semanalmente em camundongos. As amostras biológicas (glândula salivar e intestino) serão obtidas através de dissecação dos insetos em PBS utilizando-se um microscópio estereoscópico. 3.2 Ensaios do sistema do complemento humano Ensaios hemolíticos serão usados para avaliar o status de ativação do complemento humano ingerido e testar a capacidade das amostras biológicas de C. lectularius em inibir a via clássica e alternativa. Hemácias de carneiro opsonizadas com anticorpos (via clássica) e hemácias de coelhos (via alternativa) serão incubadas com soro humano normal, na presença e na ausência das amostras biológicas. A quantificação da lise mediada pelo complemento será feita através da dosagem da hemoglobina a 415 nm no sobrenadante do ensaio (Silva et al., 2016). A capacidade das amostras biológicas de C. lectularius em inibir a via das lectinas será testada de acordo com Mendes Sousa et al. (2016). Placas de ELISA serão cobertas com manana e incubadas com soro humano na presença e na ausência das amostras biológicas. A ativação da via das lectinas será mensurada através da detecção do componente C4 na superfície da placa. 3.3 Ensaios para determinar o ponto de inibição do complemento humano Com o objetivo de descobrir em qual ponto da cascata do complemento ocorre inibição, ensaios de ELISA serão realizados (Mendes Sousa et al., 2016). Os poços de placas de ELISA serão cobertos com IgG (via clássica), agarose (via alternativa) e manana (via das lectinas) e incubados com soro na presença ou ausência de amostras biológicas. A deposição de diversos componentes ao longo cascata do complemento (MBL, C1q, C4b, C3b, fator Bb, C5b e C9) será avaliada utilizando-se anticorpos específicos, de modo que será possível saber o ponto que a saliva ou conteúdo intestinal atua. 3.4 Ligação de moléculas reguladoras ao epitélio intestinal de C. lectularius Para avaliar a capacidade do epitélio intestinal de C. lectularius em captar moléculas reguladoras do complemento presentes no sangue humano, insetos serão dissecados e os intestinos serão abertos e incubados com soro humano normal. Após lavagem, esses intestinos serão sonicados e o material resultante será utilizado para cobrir uma placa de ELISA que será revelada utilizando-se anticorpos anti-fator H.