Revista Eletrônica do Programa de Bolsas - Edição 1

Bolsista: MATEUS MARCHETTO
Orientador(a): Lia Carolina A S Medeiros
Resumo: Leishmaniose é uma doença tropical negligenciada, com diferentes manifestações clínicas, cujos agentes etiológicos são parasitas unicelulares flagelados do gênero Leishmania spp. No Brasil, a Leishmaniose Visceral, forma mais grave da doença, é causada pelo parasita L. infantum. O tratamento quimioterápico realizado é bastante tóxico e antiquado, baseado em medicamentos antimoniais, que apresentam diversas desvantagens, e uma ferramenta vacinal eficiente ainda não está disponível. Por isso, espera-se identificar formas de modernizar o tratamento e prevenção. Nesse sentido, o flagelo da Leishmania apresenta papel crítico na interação parasita-hospedeiro, atuando na motilidade, morfogênese e divisão celular. Logo, é fundamental uma compreensão mais ampla do funcionamento das proteínas flagelares. Recentemente, Beneke, et al. (2019) utilizaram a técnica de CRISPR/Cas9 para nocautear diversos genes componentes do proteoma do flagelo da L. mexicana. Dentre eles, destacou-se o gene PF16, descoberto pela primeira vez em Chlamydomonas reinhardtii (BENEKE, et al., 2017). A inativação do gene PF16 em Chlamydomonas levou à perda do par central de microtúbulos e função flagelar anormal, mostrando que o PF16 é necessário para a motilidade flagelar e estabilidade do microtúbulo C1 do par central (STRASCHIL, et al., 2010). Nesse sentido, o defeito derivado do nocaute do gene resultou em paralisia total da L. mexicana, se assemelhando ao defeito do mutante PF16 Chlamydomona reinhardtii, indicando que a proteína é um componente axonemal bem conservado. O presente projeto, portanto, se propõe a obter e caracterizar parasitas nocaute para PF16 em L. infantum e avaliar sua capacidade infectiva. Mais especificamente, pretendemos realizar o nocaute do gene que codifica para a proteína flagelar PF16 em L. infantum por CRISPR-Cas9; avaliar a motilidade e comportamento do flagelo das formas promastigotas de L. infantum nocautes através de ensaios de motilidade por vídeo microscopia; e avaliar a capacidade de infecção in vitro de L. infantum nocautes em macrófagos derivados de células THP-1. Assim, o presente projeto visa abrir caminhos para a descoberta de novos alvos quimioterápicos na Leishmaniose em humanos, além de uma possível ferramenta vacinal.

Bolsista: KAIO CALLEBE PEDRO FERREIRA
Orientador(a): LIA LAURA LEWIS XIMENEZ DE SOUZA RODRIGUES
Resumo: O vírus da hepatite C (HCV) ainda é um problema de saúde pública mundial, consistindo em uma das principais causas de transplante hepático no mundo. Estima-se que existam 58 milhões de pessoas infectadas pelo HCV, sendo cerca 29 mil mulheres em idade reprodutiva, dentre as quais 8% são mulheres gravidas. No Brasil, estima-se uma prevalência de HCV entre 0,2 e 1,4% em gestantes. Apesar de ser principalmente transmitido pela via parenteral, o HCV também é transmitido pela via intrauterina. Estudos demonstram que a cargas virais elevadas (>106UI/mL) durante o período gestacional pode ser uma variável significante para transmissão materno-infantil (TMI). Os riscos de complicações gestacionais e neonatais (diabetes gestacional, colestase intra-hepática, pré-eclâmpsia, restrição de crescimento, hemorragia pré-parto, parto pré-termo, aborto espontâneo, cirrose e carcinoma hepatocelular) são notáveis em mulheres portadoras crônicas do HCV. Entretanto, essa associação ainda não é tão clara. Alguns estudos sugerem que esse fato pode estar relacionado a diversos fatores, dentre estes, fatores imunogenéticos e epigenéticos. Esses desfechos desfavoráveis e possíveis doenças hepáticas durante a gestação, podem ser mediados e preditos pela expressão de micro RNAs (miRNAs) e SNPs que regulam genes do hospedeiro. Desta forma, este trabalho visa a investigação da variabilidade genética viral, identificação de mutações de resistência, além da investigação de determinados SNPs e miRNAs que podem ser possíveis marcadores genéticos ligados complicações gestacionais em gestantes infectadas pelo HCV.

Bolsista: JAIME ALEX MARQUES DA SILVA FILHO
Orientador(a): Marcos André Vannier dos Santos
Resumo: A doença de Chagas (DC) atinge cerca de 8 milhões de pessoas no mundo. No Brasil o número de portadores pode superar 2% da população nacional. O tratamento preconizado está baseado no uso do benzonidazol (BZ) e do nifurtimox (NFX) que são considerados pouco eficazes nos casos crônicos tardios da doença, os quais são majoritários e, que frequentemente, permanecem sem receber tratamento. Assim sendo, estratégias terapêuticas alternativas na quimioterapia da DC, são de grande relevância para a saúde pública de nosso país. Nossa equipe depositou uma patente (INPI, PI 090O8B1-0 A2) e atualmente a abordagem se encontra na realização de ensaio clínico, que propõe a combinação de um composto pró-oxidante com um antagonista de sistema antioxidante para o tratamento da DC. Combinações de drogas promovem a seletividade e simultaneamente dificultam o surgimento de cepas resistentes, possibilitando o emprego de baixas concentrações dos fármacos, o que pode reduzir os efeitos colaterais. Na presente proposta, pretendemos avaliar a ação tripanocida da combinação do POD1 e/ou POD2 com o Nifurtimox. Serão testadas em formas epimastigotas de T. cruzi (cepa Y) em diferentes concentrações dos compostos isolados e combinados para determinação de eventuais efeitos sinergísticos. Será avaliado a indução da produção de espécies reativas de oxigênio com sondas DHE e DCH2FDA, que poderão ser evidenciados por microscopia de fluorescência, e ultraestruturalmente. A citotoxicidade dos compostos será avaliada pela técnica de Alamar Blue em células de linhagem VERO. Pretendemos encontrar uma combinação sinergística, seletiva que possa ingressar em nosso arsenal terapêutico em menos tempo e a reduzidos custos de desenvolvimento, favorecendo a utilização no SUS.

Bolsista: Thatiane Luca Marques de Almeida
Orientador(a): LUIZ ANASTACIO ALVES
Resumo: O hepatocarcinoma é hoje o 5ª diagnóstico mais comum de câncer entre homens e o 7ª entre mulheres e leva à morte de aproximadamente 600.000 pessoas por ano em todo o mundo. O câncer hepático é uma doença extremamente debilitantes, tendo em vista o papel do fígado na síntese de fatores de coagulação, albumina, glicídios, hormônios, entre outros, além de suas funções desintoxicantes. Apesar do grande avanço no tratamento de tumores, as terapias e os fármacos disponíveis atualmente incluem procedimentos que, embora sejam eficientes, apresentam pouca seletividade, danificando estruturas e células saudáveis adjacentes e sistêmicas, o que acarreta em muitos efeitos colaterais para o paciente. Dessa maneira, o desenvolvimento e/ou aprimoramento de novas abordagens terapêuticas é importante devido à crescente incidência de câncer pelo mundo. E a Terapia Fotodinâmica (TFD) surge como um desses tratamentos. Sendo considerada uma alternativa menos invasiva e mais específica quando comparada com os tratamentos tradicionais, a TFD se baseia na utilização de um composto fotossensibilizador (FS), que ao ser excitado por uma fonte de luz de comprimento de onda específico, passa de um estado molecular fundamental para um estado excitado, e ao retornar a seu estado basal promove a geração de espécies reativas de oxigênio (ROS) que vão ser responsáveis por induzir a destruição do tecido irradiado. O azul de metileno (AM) se destaca, dentre os FS utilizados, devido a sua baixa citotoxicidade no estado fundamental e seu alto rendimento quântico, além de ser um composto já aprovado para uso terapêutico e ser uma opção de baixo custo para a terapia. Entretanto, o AM apresenta baixa permeabilidade celular em decorrência da sua polaridade. Assim, meios que facilitem a passagem do AM pela membrana celular, como a utilização de peptídeos permeantes de membrana (CPPs) e a indução da ativação dos receptores P2X7 seriam formas de potencializar o efeito da terapia. Uma das possibilidades para aumentar a permeabilidade do azul de metileno seria a utilização de poros de membrana catiônicos ativados por receptores da família P2XR, que é expressa nos hepatócitos e em várias outras células. O receptor P2X possui o ATP como agonista, sendo, dessa forma, um alvo interessante para a internalização do AM em células tumorais de fígado. Por outro lado, outra alternativa a ser explorada no projeto é a utilização de peptídeos permeantes de membrana (CPPs), como a penetratina. Esse peptídeo com menos de 13 aminoácidos possui a ímpar característica anfipática e exerce a função de carreadora de fármacos ou moléculas catiônicas do meio extracelular para o meio intracelular. A TFD apresenta limitações com relação à aplicação da terapia em tumores profundos, como o hepatocarcinoma, de maneira que a utilização de nanopartículas busca aprimorar a eficácia da terapia em tumores de difícil localização. Essas nanopartículas seriam excitadas através da utilização de raios-x de baixa intensidade, de maneira que esses nanocintiladores emitam luz, ativando assim o fotossensibilizador. Assim, neste projeto pretendemos investigar a eficiência da Terapia Fotodinâmica em modelos de tumores in vitro e in vivo, usando AM e outros fotossensibilizadores, bem como avaliar a otimização da permeabilidade do AM através dos agentes permeabilizantes e o uso das nanopartículas radioluminescentes excitadas por raios-x visando o tratamento de tumores profundos

Bolsista: ANDRE MONTEIRO DE BARROS TITONELLI
Orientador(a): MARISA ZENAIDE RIBEIRO GOMES
Resumo: Stenotrophromonas maltophilia é um bacilo Gram-negativo e patógeno oportunista de relevância crescente na sepse. A importância do desenvolvimento deste estudo se deve aos seguintes fatos: (1) sepse hospitalar é causa importante de morbimortalidade, que gera considerável impacto financeiro; (2) S. maltophilia requer uma terapia diferenciada, não coberta pelos esquemas antimicrobianos empíricos utilizados em sepse; (3) esse agente vem crescendo em importância como causa de sepse em CTI, com relatos de resistência ao tratamento clássico; (4) não há definição na literatura sobre os fatores de risco para sepse por S. maltophilia; (5) importante descrever as características epidemiológicas, clínicas e microbiológicas, incluindo a letalidade, frente às sepses por S. maltophilia. Logo, o estudo dos fatores de risco para infecção por S. maltophilia, no contexto da sepse em CTI, é necessário para que medidas de prevenção, diagnóstico e tratamento sejam melhores direcionadas. Nesse sentido, temos como objetivo principal identificar os fatores preditivos para infecção por S. maltophilia em pacientes adultos no contexto da sepse hospitalar, em CTI médico-cirúrgico, de um hospital público terciário do Rio de Janeiro, entre 08/2015 e 12/2017. Como objetivos específicos: descrever as características demográficas, epidemiológicas e clínicas das infecções por S. maltophilia na população de estudo; caracterizar o processo infeccioso por S. maltophilia, conforme critérios pré-estabelecidos, em infecção persistente, reinfecção, superinfecção e infecção breakthrough; descrever o perfil fenotípico de resistência antimicrobiana nas infecções por S. maltophilia na população de estudo; e descrever a letalidade da sepse por S. maltophilia. Este subprojeto é parte da pesquisa principal: “Diagnóstico e tratamento de sepse por bacilos Gram-negativos em centros de tratamento intensivo do Rio de Janeiro”, que tem o Instituto Oswaldo Cruz – Fundação Oswaldo Cruz como instituição proponente e, como instituição coparticipante, o hospital onde se encontra o CTI investigado. Além disso, o subprojeto é parte de um mestrado na Pós-graduação em Medicina Tropical do IOC-FIOCRUZ. Trata-se de um estudo de coorte prospectiva de pacientes adultos que apresentaram episódios primários e recorrente (s) de sepse, em mesma internação, no CTI médico-cirúrgico de um hospital federal, terciário, do Rio de Janeiro, no período de 08/2015 a 12/2017. Todos os pacientes que tiveram hemoculturas foram investigados quanto aos demais critérios de inclusão e exclusão da pesquisa. Serão investigadas nesse subprojeto, variáveis que se encaixam nos seguintes grupos: fatores do paciente, comorbidades do paciente, procedimentos médicos, material de origem da cultura, exames laboratoriais no período da hemocultura inicial, uso prévio de antimicrobianos, e desfecho do caso. Fatores do processo infeccioso como etiologia e nível de resistência aos antimicrobianos, foco e plausibilidade da infecção, infecção breakthrough, infecção persistente, reinfecção e superinfecção de acordo com os critérios de Klein Klouwenberg et al. (2013) adaptados. Uma análise descritiva dos episódios de sepse será realizada por meio de gráficos e tabelas. Para variáveis categóricas utilizaremos o teste qui-quadrado ou o teste exato de Fisher. Para variáveis contínuas faremos teste U de Mann–Whitney. O nível de significância ? 0.05 será adotado em todas as análises. Uma análise estatística univariada será realizada para determinar possíveis fatores associados a sepse por S. maltophilia. Como atividades e cronograma, realizaremos revisão bibliográfica; monitoramento de dados coletados dos pacientes no REDCap; participação das análises estatísticas, de divulgação dos resultados em Congressos Nacionais e Internacionais, e em publicações em Revistas Científicas, no período de vigência da bolsa de iniciação científica.

Bolsista: IGOR MELLO DA ROCHA CORPAS MACIEL
Orientador(a): MARCIO GALVAO PAVAN
Resumo: Justificativa e Relevância Entre 2015-2017, foi registrada a reemergência do vírus amarílico (YFV) no Brasil, se alastrando na região silvestre de sua área endêmica (Amazônia e parte do Centro-oeste) para a Mata Atlântica, região considerada indene por quase 80 anos (Abreu et al. 2019). Identificar corretamente os vetores responsáveis pela transmissão do vírus é fundamental para o mapeamento de riscos de transmissão. Neste bioma está presente o vetor primário da doença, Haemagogus janthinomys, que é encontrado em praticamente toda a região tropical das Américas. Esta espécie é ocorre em simpatia em grande parte da distribuição de Hg. capricornii, que é restrita a Mata Atlântica da região sudeste e do sul da Bahia. Estas espécies são diferenciáveis apenas a partir da genitália masculina, pelo olhar de taxonomistas experientes (Silva et al. 2019). Dada a co-ocorrência e a falta de caracteres diagnósticos adicionais, restam ainda dúvidas se Hg. janthinomys e Hg. capricornii representam na realidade variações fenotípicas de uma mesma espécie. No caso de no fato serem unidades taxonômicas distintas, ainda não se sabe de fato o papel epidemiológico que a última espécie tem na Mata Atlântica. Objetivos Gerais e Específicos Analisar filogeneticamente o status taxonômico de Hg. janthinomys e Hg. capricornii e o papel epidemiológico de ambas as espécies no último surto de YFV na Mata Atlântica. Objetivos específicos - Desenhar iniciadores específicos para a amplificação de fragmentos dos genes citocromo oxidase II (coxII) e citocromo b (cytb) com base no genoma mitocondrial de Hg. janthinomys. - Sequenciar para populações de Hg. janthinomys e Hg. capricornii os dois marcadores mitocondriais (coxII e cytb), além de um marcador ribossomal (ITS-2) e um nuclear (white). - - Analisar filogeneticamente os marcadores moleculares sequenciados. - Genotipar amostras positivas para YFV. Metodologia Resumida Amostragem Foram coletados 643 espécimes de Hg. janthinomys/capricornii em 30 localidades da Mata Atlântica, dos estados do Rio de Janeiro, Minas Gerais e São Paulo (SISBIO 52472-5, INEA 019/2018). Ao todo, foram feitos 162 pools, dos quais 20 foram positivos para YFV (12,3%). Sessenta machos de 10 localidades da Mata Atlântica foram separados para as análises filogenéticas, dos quais a partir da identificação morfológica de suas genitálias observamos que 25 são Hg. capricornii e 35 são Hg. janthinomys. Desenvolvimento de iniciadores O desenvolvimento de iniciadores para coxII e cytb mtDNA será feito utilizando os programas Primer3 e a ferramenta Blast, disponíveis online (Primer-Blast). O genoma mitocondrial de Hg. janthinomys (NC_028025) será utilizado como modelo. Pretende-se amplificar um fragmento de 500-850pb de cada marcador. Extração de DNA, PCR, Sequenciamento e Análises Filogenéticas A extração de DNA será feita utilizando o kit DNA Tissue and Blood (Quiagen). A amplificação dos fragmentos do gene white e ITS-2 serão feitas com iniciadores e condições já publicados (Wesson et al. 1992; Redenbach et al. 2009). Diferentes concentrações de reagentes e de ciclagem da PCR serão testadas para coxII e cytb. As amostras serão submetidas a reações de sequenciamento pelo método de Sanger, como descrito em Ribeiro et al. (2020). O sequenciamento será realizado no ABI 3730 (Applied Biosystems) na Plataforma PDTIS/FIOCRUZ. O tratamento das sequências, assim como as análises filogenéticas serão feitas por métodos de distância genética e de reconstrução pelos métodos de máxima verossimilhança e inferência bayesiana, assim como descritos em Ribeiro et al. (2021). Caso seja possível diferenciar Hg. janthinomys de Hg. capricornii, os marcadores mais variáveis entre as espécies serão utilizados para identificação dos insetos presentes nos pools positivos para YFV (uma alíquota de cada espécime que compõem os 20 pools positivos está armazenada em freezer). Cronograma Meses 1-5: Desenho de iniciadores para os genes coxII e cytb e ensaios da PCR. Meses 6-10: Amplificação dos fragmentos e sequenciamento de DNA dos quatro marcadores. Meses 8-12: Análises filogenéticas, escrita de relatórios e artigo científico. Bibliografia Abreu et al. Emerg Microb Infect 8, 218 (2019) Reidenbach et al. BMC Evol Biol 9, 298 (2009) Ribeiro et al. Zootaxa 4830 (2020) Ribeiro et al. Zootaxa 4999, 534 (2021) Silva et al. Rev Soc Med Trop 52 (2019) Wesson et al. Mol Phyloget Evol 1, 253 (1992)