Revista Eletrônica do Programa de Bolsas - Edição 1

Bolsista: Laura de Azeredo Santos
Orientador(a): Marcio Sacramento de Oliveira
Resumo: A Chikungunya é uma doença viral transmitida aos humanos pelas picadas de mosquitos fêmeas infectados que causa febre e fortes dores nas articulações. A doença foi reconhecida pela primeira vez em 1952, durante um surto no sul da Tanzânia. Em 2016, havia um total de 349.936 casos suspeitos e 146.914 confirmados por laboratório notificados ao escritório regional da OPAS, representando metade da carga em comparação com o ano anterior. Os países que notificaram a maioria dos casos foram Brasil, Bolívia e Colômbia (com cerca de 300.000 casos suspeitos entre eles). Em 2017, o ECDC notificou um total de 10 países, com 548 casos de Chikungunya, dos quais 84% foram casos confirmados. O Paquistão enfrentou um surto persistente que começou no ano anterior e relatou 8.387 casos, enquanto a Índia sofreu com 62.000 casos. Nas Américas e no Caribe foram notificados 185 mil casos; os casos no Brasil representaram mais de 90% dos casos na região das Américas. Surtos de Chikungunya também foram relatados no Sudão (2018), Iêmen (2019) e, mais recentemente, no Camboja e Chade (2020). Diante deste cenário de possibilidades de novas epidemias por Chikungunya, sobretudo no Brasil, devido ao cenário de crise econômica que o país passa nos últimos anos e a atual crise sanitária afetando os investimentos em PD&I, definir prioridades de investimento e priorizar políticas realmente efetivas, se faz necessária a realização de estudos prospectivos direcionados a atender demandas específicas. O projeto tem por objetivo análisar a produção científica e tecnologica global sobre a Chikungunya. A metodologia consite na recuperação de registros em chikungunya, sobre a perspectiva da Vigilância em Saúde, nas bases Web of Science e Scopus para produção científica e no Orbit Intelligence para produção tecnológica, no período de 2010 a 2022. Através das técnicas de text e data mining será desenvolvida uma base de dados organizada e estruturada para a realização de análise bibliométrica. Serão utilizados os softwares Vantagepoint (Marca Registrada) e VOSviewer para as etapas de tratamento e de análise dos dados.

Bolsista: Mylena Euphrazio dos Santos
Orientador(a): DANIELLY CORREA MOREIRA
Resumo: PROJETO Ensaio citofluorimétrico para caracterização fenotípica das células envolvidas nas respostas do tipo Th1 e regulatória de camundongos imunocompetentes e imunossuprimidos infectados com espécies do complexo Sporothrix. Orientadores Orientadora: Danielly Corrêa Moreira de Sequeira Co-orientador: Manoel Marques Evangelista de Oliveira Palavras-chave: Sporothrix, esporotricose, relação parasito-hospedeiro, resposta imune, modelo murino 1. Introdução e justificativa Sporothrix schenckii é um fungo dimórfico, que pertence à Divisão Ascomycota, Classe Pyrenomycetes, Ordem Ophiostomatales, Família Ophiostomataceae (Marimom et al, 2006), cuja fase micelial, saprófita, é obtida também em cultura a 25ºC e sua fase leveduriforme, parasitária, é obtida em meio BHI (Brain Heart Infusion), em temperaturas que variam entre 35°-37°C. Até 2006, S. schenckii era considerada a única espécie patogênica, entretanto, estudos filogenéticos demonstraram uma variabilidade genética entre as espécies de S. schenckii (Marimon et al., 2006; de Meyer et al., 2008 ), atualmente considerada um complexo de espécies, inicialmente composto por S. schenckii sensu stricto, S. brasiliensis, S. globosa, S. luriei, S.mexicana, S.pallida e S. chilensis todas consideradas patogênicas (Marimon et al., 2007, 2008; 2009; Dias et al., 2011; Morrison et al., 2013; Cruz-Choappa et al., 2014; Rodrigues et al., 2016). Na imunopatogênese das infecções fúngicas, as células T regulatórias (Tregs), são responsáveis por manter a homeostase por diversos mecanismos, como por exemplo, a supressão dos efeitos deletérios de células Th2 (Wiesner et al., 2016) e da ação de neutrófilos por meio da ação combinada de IL-10 e CTLA-4 (Montagnolli et al., 2006). Com base no exposto, nos propomos a avaliar a geração de células T regulatórias em camundongos imunocompetentes e imunossuprimidos infectados com as espécies S. schenkii stricto sensu e S. brasiliensis, isolados de uma área de epidemia de grande impacto como o Rio de Janeiro, com o objetivo de ampliar o conhecimento sobre mecanismos imunológicos envolvidos na resposta contra essas duas espécies. Sendo assim, a justificativa desse trabalho se baseia no escasso conhecimento sobre as bases celulares e imunológicas da interação de Sporothrix com os hospedeiros. Os registros na literatura são relatos de casos clínicos, sem aprofundamento do entendimento da interação parasito-hospedeiro. Os trabalhos experimentais utilizando modelos murinos, estudaram a virulência dessa espécie e o estabelecimento da doença em hospedeiros imunocompetentes e imunossuprimidos, sem aprofundar a resposta imunológica. 2. Objetivo Analisar a resposta à infecção, in vivo, de camundongos C57BL/6, imunocompetentes e imunossuprimidos, frente a conídios de Sporothrix spp., por meio de citometria de fluxo dos linfócitos T destes animais. 3. Metodologia Citometria de fluxo: Esplenócitos serão recuperados dos baços coletados durante as necropsias dos animais (grupo I a IV), para análise por citometria de fluxo. As hemácias serão lisadas a partir da adição de tampão de lise por baço. Após, serão realizadas 3 lavagens consecutivas com tampão de coloração gelado e transferidas para os tubos FACS, centrifugadas , e descartado o sobrenadante. Ao pellet serão adicionados anticorpos monoclonais marcados com fluorocromos (CD4, CD8, FoxP3), na tentativa de verificar a expressão dos marcadores de superfície para os subtipos de células T. Após incubação, as células serão lavadas com tampão de coloração e fixadas por incubação com paraformaldeído. Posteriormente, serão transferidas para mini-tubos e estocadas até o momento da aquisição no citômetro de fluxo MoFlo. Para análise dos dados obtidos, será utilizado o software FlowJo.

Bolsista: GEOVANA ESPINDOLA JARDIM
Orientador(a): Robson Xavier Faria
Resumo: O receptor purinérgico P2X7 é um canal ativado fisiologicamente pela adenosina 5’-trifosfato (ATP) extracelular e está distribuído amplamente em mamíferos, incluindo células de linhagem hematopoiética, como macrófagos e micróglias. Uma breve exposição ao ATP extracelular permite que cátions, como Ca2+, Na+ e K+, passem pela membrana. Uma estimulação prolongada induz a formação de um poro permitindo a entrada de moléculas de até 900 Da, como corantes orgânicos. Além disso, o P2X7 é responsável por regular eventos celulares, incluindo liberação de citocinas pró-inflamatórias, como interleucina-1? (IL-1?), IL-6, TNF-? e a morte celular. Uma vez liberadas, essas citocinas desempenham papel como mediadores intracelulares de geração e controle de resposta imune e inflamatória. Nesse contexto, estudar o funcionamento do P2X7 torna-se limitado pela falta de antagonistas seletivos com potente atividade in vitro e in vivo nos modelos animais e propriedades farmacocinéticas e farmacodinâmicas apropriadas em humanos, que demonstrem efeito superior à droga de referência em ensaios clínicos. De fato, as substâncias estudadas até o momento, por outros grupos científicos e indústrias farmacêuticas, falharam essencialmente em ensaios clínicos para a artrite reumatoide. Em trabalhos anteriores do nosso grupo, após uma triagem, foram selecionados naftoquinonas, ácido borônicos e triazóis e pirazóis que apresentaram inibição do P2X7, com IC50 na faixa de nanomolar, sem toxicidade celular após 72h de exposição, CC50 acima de 100 micromolar, e redução da inflamação no modelo de edema de pata. Neste trabalho, daremos continuidade ao estudo desses compostos, in vivo, avaliando a atividade anti-inflamatória no modelo de peritonite induzida pela carragenina em camundongos. Três naftoquinonas (N1, N2 e N3), 4 ácidos borônicos (AB1, AB2, AB3 e AB4), 3 triazóis (T1, T2 e T3) e 6 tiadiazóis TI1, TI2, TI3, TI4, TI5 e TI6) serão estudadas quanto a capacidade de reduzir a migração de células inflamatórias no modelo de peritonite induzida por carragenina. Usaremos este modelo para verificar se antagonistas seletivos para este receptor são capazes de reverter uma reposta inflamatória causada por um mediador geral, como a carragenina. Todos os compostos terão suas atividades comparadas ao Brilliant Blue G (BBG), um antagonista do receptor P2X7R e da dexametasona. Adicionalmente, investigaremos a toxicidade aguda em dose única destas substâncias. A atividade das substâncias nestes protocolos é um alicerce para se expandir os estudos em modelos experimentais de sepse, inflamação crônica, como o da artrite reumatoide induzida por colágeno, e outros testes de toxicidade.

Bolsista: GABRIEL CARVALHO DO NASCIMENTO
Orientador(a): ADEMIR DE JESUS MARTINS JUNIOR
Resumo: A resistência a inseticidas (RI) é uma ameaça ao controle de insetos vetores, em escala global. Temos alcançado importantes avanços na investigação de alterações fisiológicas selecionadas para o fenótipo da resistência, que contribuem para a vigilância e monitoramento da RI em populações naturais. Entre as alterações conhecidas para a RI em Aedes aegypti, vetor de arbovírus, as mutações kdr, que conferem resistência ao efeito knockdown dos piretroides, são as que vem sendo mais amplamente estudadas e documentadas. A RI, seja por kdr ou outro mecanismo, geralmente acarreta um custo no fitness do inseto em ambientes livres de inseticida. Uma das hipóteses mais aceitas é que tais efeitos deletérios aconteçam porque as alterações para a RI requerem uma alta quantidade de energia, que naturalmente seria utilizada para funções normais do inseto. Neste projeto, estamos investigando se populações de Ae. aegypti com diferentes níveis de RI, bem como linhagens com diferentes genótipos kdr, quando mantidas em laboratório sob as mesmas condições ambientais, apresentam concentrações distintas de macromoléculas enérgicas, como proteínas, carboidratos, glicogênio e lipídeos. Até então mostramos que, no geral, larvas destas populações e linhagens apresentaram concentrações semelhantes. Precisamos finalizar as análises de lipídeos, e realizarmos ensaios similares com mosquitos adultos. Além disso, incluiremos populações de diferentes regiões geográficas do país, independente de seus perfis de RI, a fim de testarmos se a variável origem geográfica, com mosquitos provenientes de biomas distintos, contribuirá com diferenças na composição daquelas moléculas energéticas.

Bolsista: LAURA DE OLIVEIRA BORGES
Orientador(a): VALERIA CAVALCANTI ROLLA
Resumo: Tuberculose (TB) é uma doença infecciosa cujo agente etiológico é um bacilo álcool-ácido resistente (BAAR), denominado Mycobacterium tuberculosis (MTB). O diagnóstico inicial de TB é obtido através de achados clínicos e radiológicos e confirmado a partir da realização de exames tais como a baciloscopia e a cultura (este último considerado padrão-ouro) preconizados pelo Ministério da Saúde para confirmação de casos de TB (BRASIL, 2008). Após décadas de estagnação no campo diagnóstico avanços surgiram a partir de 2010 com os testes rápidos moleculares. TUBERCULOSE CUTÂNEA - TB cutânea é uma forma extrapulmonar considerada rara. Apenas 14% dos diagnósticos de TB são da forma extrapulmonar sendo, 1-2% na forma cutânea (PACHECO et al., 2015). O diagnóstico de TB cutânea é feito pela baciloscopia (BAAR em exame direto), que apesar de simples e rápida tem rendimento baixo, ou por meio de cultura (em meio sólido ou líquido) ou a presença do granuloma com necrose caseosa no fragmento de biopsia, cujo rendimento varia muito (BRASIL, 2008) e é menor que 10% (ZHANG, 2016) A cultura do material biológico em meios sólidos utiliza meios como Löwenstein-Jensen e Ogawa-Kudoh. O tempo de detecção do crescimento varia de 14 a 30 dias, podendo se estender por até 8 semanas. Entretanto, o isolamento de MTB na cultura de lesões cutâneas é baixo (23%), (BRASIL, 2011). O Xpert® MTB/RIF é um teste de amplificação de ácidos nucleicos utilizado para detecção do complexo MTB e resistência a rifampicina. A sensibilidade do teste em amostras respiratórias com resultado de baciloscopia positivo varia de 98% a 100%, porém, o teste foi capaz de detectar até 78% dos casos negativos à baciloscopia. A especificidade do teste, pode variar de 90,9% a 100% em relação à cultura (VAN RIE et al., 2010). Atualmente, o teste Xpert® MTB/RIF foi substituído pelo Xpert® MTB/RIF Ultra com um limiar menor para detecção de MTB e maior especificidade em relação à resistência podendo ser utilizado em vários espécimes clínicos incluindo a pele (DORMAN et al., 2018) . JUSTIFICATIVA O avanço na tecnologia permitiu o desenvolvimento de ferramentas com maior capacidade diagnóstica, em especial testes rápidos moleculares. Após o surgimento do Xpert® MTB/RIF Ultra alguns estudos comparando a performance do Xpert® MTB/RIF e do Xpert® MTB/RIF Ultra em diferentes espécimes clínicos mostraram uma maior sensibilidade e especificidade do Ultra (CHAKRAVORTY et al., 2017) que passou a ser usado na rotina diagnóstica de muitos centros de pesquisa Um estudo de coorte desenvolvido no Laboratório de Pesquisa Clínica em Micobaceterioses denominado “Fatores determinantes da sobrevida em indivíduos com tuberculose infectados ou não por HIV” está em andamento e inclui TB em qualquer de suas formas clínicas, com informações sobre o diagnóstico dos diversos casos. Não existe até o momento estudos com Xpert®MTB-RIF e Xpert®ULTRA abordando as diversas apresentações de TB cutânea. A revisão destes casos pode ser especialmente interessante e detalhada para avaliação dos testes no diagnóstico de TB cutânea. OBJETIVO : Avaliar a performance do teste Xpert® MTB/RIF e do Xpert® MTB/RIF Ultra no diagnóstico da TB extrapulmonar forma cutânea comparado com o resultado de cultura. PACIENTES E MÉTODOS Estudo de coorte retrospectivo com dados secundários coletados do estudo no Laboratório de Pesquisa Clínica em Micobacterioses (LAPCLIN/TB) do Instituto Nacional de Infectologia Evandro Chagas (INI) FIOCRUZ, Rio de Janeiro. Todos os pacientes com TB cutânea com diagnóstico clínico, laboratorial (baciloscopia e/ou, cultura e/ou histopatológico) no período de janeiro de 2014 a dezembro de 2021. Estima-se uma casuística de 30 pacientes. Serão incluídos todos os casos de TB cutânea registrados no estudo de sobrevida. Serão excluídos os casos sem dados de Xpert®. A coleta dos dados dos pacientes ocorrerá através da revisão de prontuários de casos de TB cutânea registrados no banco de dados do estudo. Os resultados de exames serão captados através do prontuário eletrônico do INI. Um banco de dados será construído no programa Excel versão 2013. As análises serão feitas no programa SPSS versão 2013. O projeto de pesquisa utilizará dados obtidos do estudo “fatores determinantes da sobrevida em indivíduos com TB infectados ou não por HIV” que foi aprovado no Comitê de Ética em Pesquisa, do INI, e recebeu o número 002/00.

Bolsista: GABRIELA BRAGA SOUZA
Orientador(a): INGO RIEDERER
Resumo: A utilização de células-tronco para o tratamento de lesões ou doenças degenerativas esbarra em diversos desafios, como a reprodutibilidade em ensaios clínicos. De fato, a capacidade regenerativa das células-tronco adultas depende do microambiente local, que pode direcionar o processo de regeneração à deposição exacerbada de matriz extracelular e culminar em disfunção tecidual. No músculo, células-tronco denominadas de células satélites ficam localizadas entre a membrana da fibra muscular e a membrana basal que envolve essa estrutura. Elas ficam em estado de quiescência, podendo ser ativadas após lesão ou trauma. Parte delas volta a apresentar características estaminais (autorrenovação), enquanto a outra parte (denominada de mioblastos) prolifera e pode se diferenciar para formar novas fibras musculares ou recuperar as fibras danificadas. Nesse contexto, os macrófagos, através de citocinas liberadas exercem um papel central para o sucesso regenerativo. O GDF11 faz parte da família do TGF-?, e dois membros dessa família, TGF-? e Miostatina (GDF8), tem papel fundamental, e bem documentado, na regeneração muscular esquelética, tanto em situações fisiológicas quanto patológicas1. Foi sugerido que GDF11 poderia atuar como uma molécula rejuvenescedora, sendo capaz de reverter a hipertrofia cardíaca relacionada à idade2, além de restaurar a integridade genômica das células satélites envelhecidas no músculo esquelético3. Porém, estudos mais recentes mostram um papel controverso de GDF11, que poderia prejudicar a regeneração muscular e causar um aumento significativo do conteúdo de colágeno no músculo4,5,6. Nossos resultados mostram que GDF11 inibe a diferenciação e fusão de mioblastos humanos, mas é capaz de estimular a proliferação dos mioblastos. Nosso grupo demonstrou que estimular a proliferação, consequentemente retardando a diferenciação, melhorava a capacidade regenerativa de células progenitoras musculares humanas (mioblastos) transplantados em camundongos imunodeficientes7. Um dos objetivos do projeto principal é desenvolver um peptídeo otimizado de GDF11 que poderia promover uma melhor regeneração muscular, ao por exemplo, estimular a proliferação sem prejudicar a capacidade de fusão dos mioblastos. Nesse contexto é importante identificar quais células produzem GDF11 e expressam seus receptores, e que tipo de resposta celular ocorre dessa interação. Objetivos: 1) Identificar a expressão de GDF11 e seus receptores (ALK4, 5 e 7) em músculos de camundongos após lesão muscular; 2) Realizar o screening de mioblastos nocautes para ALK5 (ALK4 e 5 realizados), e analisar a proliferação, diferenciação e fusão do clone selecionado Metodologia: Imunofluorescência: músculos tibialis anterior (TA) de camundongos C57BL/10 lesionados por cardiotoxina foram coletados e parte processados com as lâminas armazenadas. Nos pontos da cinética de 24h, 72h, 5, 10 e 21 identificaremos por imunofluorescência a expressão de GDF11 e seu receptores em macrófagos, células satélites, mioblastos e fibras musculares. Screening de mioblastos (CL25) nocautes para ALK5 (ALK5-KO): Nós produzimos os vetores de expressão CRISPR/Cas9, eletroporamos, fizemos o enriquecimento das células GFP positivas e as colocamos em diluição limitante para selecionarmos os clones. A avaliação da especificidade e a eficiência da clivagem dos clones selecionados será realizada por PCR e posterior sequenciamento para confirmação e caracterização das alterações indels (inserções/deleções). Avaliação da proliferação e diferenciação do clone mutante para ALK5: mioblastos humanos da linhagem CL25, mutantes e WT serão cultivados em meio de proliferação ou diferenciação. Ensaios de incorporação de EdU e contagem celular avaliarão a proliferação, enquanto a diferenciação será avaliada pelo índice de fusão e quantificação do número e espessura dos miotubos, bem como o número de núcleos por fibra muscular revelados por DAPI e imunomarcação contra miogenina e cadeia pesada de miosina.