Revista Eletrônica do Programa de Bolsas - Edição 1

Bolsista: ISABELE PESSOA RODRIGUES DA SILVA
Orientador(a): TANIA ZAVERUCHA DO VALLE
Resumo: O debate sobre pobreza e dignidade menstrual vem crescendo nos últimos anos após a reconhecimento da ONU em 2014 sobre o direito das mulheres a uma higiene menstrual digna. Apesar disso, a discussão e ensino sobre menstruação e ciclo menstrual no Brasil ainda sofre de preconceitos. Muitas famílias consideram o tema como tabu, não dialogando com suas filhas e, mesmo nas escolas, vemos grandes lacunas sobre ensino de ciclo e saúde menstrual. Neste projeto pretendemos desenvolver um jogo de tabuleiro que possa ser usado como facilitador de diálogo e ferramenta de ensino em saúde nas escolas. Quando pronto, disponibilizaremos o jogo em formato “imprime e jogue” no site do IOC e plataforma Educare, de forma a atingir um público amplo.

Bolsista: Rafaela Scardini de OLiveira
Orientador(a): Flavia Carneiro
Resumo: A leucemia linfoide aguda de células T (LLA-T) representa de 12% a 15% de todos os casos de LLA em crianças e 25% em adultos, sendo que 20% dos pacientes entram em recidiva dentro de 2 anos após o diagnóstico. A doença recorrente é muito difícil de ser curada. Nesta fase, o transplante de medula óssea é o único tratamento que pode levar à cura, mas a reintrodução da remissão é um pré-requisito e isso é um desafio. O presente projeto propõe a identificação de alvos terapêuticos através de uma nova abordagem onde os genes alvos serão identificados pela análise combinada do interatoma e transcriptoma humanos (Carels et al., 2015). É esperado que a inibição de proteínas de alta conectividade e superexpressas em células malignas promova maior desarticulação nas redes de sinalização e as encaminhem para morte celular com menor incidência de efeitos colaterais para os tecidos saudáveis. Portanto, os novos alvos a serem identificados vão representar proteínas superexpressas e com maior grau de conectividade. O objetivo geral desse projeto é identificar novos alvos terapêuticos para LLA-T e validar in vitro os 5 mais promissores. Objetivos específicos: 1) Quantificação dos transcritos a partir dos dados de RNA-seq disponíveis nos bancos de dados. Iremos analisar os dados de RNA-seq de linhagens celulares de LLA-T, pacientes e células T e timócitos não leucêmicos (controles). O perfil de expressão gênica será avaliado por meio da taxa de identidade das sequências (tags) de RNA-seq com o conjunto das sequências humanas (BLASTn). A contagem de tag por gene será normalizada de acordo com os métodos descritos por Mortazavi et al. (2008) e Bullard et al. (2010). Os valores de expressão (contagem dos tags após normalização) da célula maligna serão subtraídos dos valores de expressão do controle. Os valores positivos indicam aumento do nível de expressão nas células tumorais. Para selecionar os genes superexpressos, utilizaremos como limiar um intervalo de confiança de 99%, considerando uma classificação one tail na base da distribuição gaussiana. 2) Escolha das proteínas com maior grau de conectividade nos subinteratomas de genes regulados positivamente como sendo alvos terapêuticos Com a lista dos genes regulados positivamente iremos identificar o sub-interatoma correspondente por comparação com o interatoma da EBI. A associação dos dados de transcriptoma e de interatoma permitirá identificar as proteínas reguladas positivamente que apresentam o maior potencial de se conectar com outras (hubs). As 5 proteínas com maior potencial de conexões reguladas positivamente serão consideradas como alvos para os testes de validação in vitro. 3) Knockdown dos alvos pela técnica de RNAi e/ou Knockout por Crisper/CAS9. Para a validação dos genes, usaremos linhagens celulares derivadas de LLA-T e, como controle, linfócitos do sangue periférico de doadores não portadores de leucemia para avaliarmos o efeito do knockdown/knockout dos genes. O knockdown dos alvos será feito pela técnica de RNAi. Moléculas de shRNA específicas para os genes identificados nos objetivos 1 e 2 serão adquiridas comercialmente e as linhagens celulares derivadas de LLA-T assim como os linfócitos controle, serão transduzidas os vetores contendo os shRNA de forma individual ou em conjunto. Alternativamente, o knockout dos genes poderá ser feito via Crisper/CAS9. Posteriormente a proliferação, viabilidade e apoptose serão avaliados. 4) Avalição da viabilidade e proliferação celular: Realizaremos contagem das células usando azul de tripan para verificar a proliferação celular e ensaios de cristal violeta e MTT (brometo de 3-(4,5-dimetil tiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazólio) para detectar a viabilidade das células. A apoptose será avaliada por citometria de fluxo, através da marcação das células com anexina V e iodeto de propídeo. Carels N et al., 2015. PLoS One 10(1):e0115054 Mortazavi A et al., 2008. Nat Methods. 5:621–628 Bullard JH et al., 2010. BMC Bioinformatics. 18:11-94.

Bolsista: GIOVANNA VIANA DO SACRAMENTO
Orientador(a): Michelle Christiane da Silva Rabello
Resumo: A COVID-19, causada pelo vírus da síndrome respiratória aguda grave coronavírus-2 (SARS-CoV-2), é responsável pela morte de milhares de pessoas. A pandemia da COVID-19 causou um significativo impacto na economia e na saúde pública de toda a sociedade. Consequentemente, outras doenças infecciosas, como a tuberculose (TB), estão sendo mais negligenciadas. Assim como a TB, a COVID-19 é transmitida por via respiratória e afeta os pulmões. Fatores de risco como idade avançada e comorbidades como diabetes, hipertensão, doenças respiratórias crônicas, entre outras, também estão associados a complicações em ambas as infecções. A interação entre essas morbidades é pouco citada na literatura. Porém, estudos recentes mostram que a coinfeção TB/COVID-19 apresenta um risco de 2,10 vezes maior do indivíduo evoluir com manifestações clínicas graves. O paciente acometido com doença respiratória prévia encontra-se com a função pulmonar prejudicada, isso resulta em uma resposta imune deficiente propiciando a síndrome respiratória aguda, ratificando essa relação. Devido à imunidade deprimida e o dano pulmonar, os pacientes com TB que adoecem com COVID-19 podem ter desfechos desfavoráveis, elevando o risco de morbidade, hospitalização e mortalidade desses pacientes. Existem poucas informações na literatura a respeito do impacto da COVID na evolução clínica e na mortalidade dos pacientes com tuberculose, especialmente nos pacientes com TB drogaresistente (TBDR) e pacientes de TB coinfectados com o virus da imunodeficeincia humana (HIV). Pesquisas científicas nacionais sobre a interação clínica entre essas infecções são necessárias no nosso país para podermos conhecer o padrão clínico, manejo clínico e prognóstico dessas infecções na nossa população. O Brasil continua entre os 30 países com alta carga de TB e de coinfecção com HIV. O Estado de Pernambuco se destaca por apresentar uma das maiores taxas de incidência e de mortalidade por TB no país. Após o período pandêmico, os indicadores epidemiológicos da TB no Brasil se agravaram tanto em relação à taxa de incidência da doença como a taxa de mortalidade. Neste estudo pretendemos conhecer o padrão clinico-epidemiológico dos casos de TB/COVID na população pernambucana e avaliar o impacto da COVID-19 no agravamento clínico e na mortalidade desses pacientes. Para isso, a partir dos bancos de dados secundários de notificações da TB, COVID-19 e do sistema de informação sobre mortalidade (SIM) iremos analisar os seguintes objetivos: 1) A série histórica dos casos de Tuberculose no município de Recife e Tuberculose drogaresistente em Pernambuco entre os períodos de 2017 a 2022; 2) Comparar o perfil sócio-demográfico e clínico-epidemiológico dos casos de tuberculose antes e após a pandemia do COVID no município de Recife; 3) Descrever o perfil sócio-demográfico e clínico-epidemiológico dos pacientes com tuberculose (TB, TBDR e TB/HIV) coinfectados com a COVID-19; 4) Avaliar o desfecho do tratamento dos casos de tuberculose e tuberculose/COVID; 5) Avaliar a causa do óbito dos casos de tuberculose do município de Recife entre os períodos de 2017 a 2022; 6)Identificar fatores de risco associados à ocorrência da evolução clínica e da mortalidade entre os casos de TB/COVID-19. Os bancos de dados do SINAN, SITETB, eSUS, NotificaPE e SIM obtidos entre os períodos de 2017 a 2022 serão disponibilizados pela vigilância epidemiológica em saúde do município de Recife. Dos quais, serão coletados as variáveis sócio-demográficas (sexo, faixa etária, raça/cor, escolaridade, e população privada de liberdade), clínica (forma da tuberculose, forma clinica da COVID-19) e epidemiológicas (parâmetros laboratoriais - teste para diagnóstico da TB, COVID-19, HIV, teste de sensibilidade às drogas anti-TB e radiológicas; fase do tratamento para TB no momento da coinfecção; desfecho do caso/situação de encerramento do caso - cura, abandono, óbito, internações; comorbidades e sintomas respiratórios. Estas variáveis serão transcritas para um banco de dados em Excel e analisadas para avaliar o impacto da COVID-19 no agravamento clínico e na mortalidade da tuberculose antes e após a pandemia.

Bolsista: JOAO VICTOR DIAS RAMOS
Orientador(a): CECILIA VIANNA DE ANDRADE
Resumo: O rastreio do câncer do colo uterino de forma sistemática e organizada leva a uma queda na incidência do câncer cervical. Mesmo com a Introdução da vacinação contra o HPV, que é efetiva e leva a uma alta proteção ao câncer cervical, o rastreio continua sendo uma importante ferramenta para reduzir as taxas de câncer cervical em pacientes não imunizadas ou com cânceres relacionados aos Tipos de HPV não contemplados pela vacina. Com a evolução do rastreio e a melhor compreensão do processo de oncogênese do carcinoma escamoso do colo uterino, o NIC2, que até pouco tempo atrás era considerado um ponto de corte inequívoco para tratamento cirúrgico, atualmente é considerado uma lesão com alto percentual de regressão. Em 2018 foi publicada uma metanálise onde o percentual de regressão da NIC2 foi estimado em 50%, persistência em 32% dos casos e 18% para progressão, levando ao conhecimento atual que a maioria das lesões de NIC2 regridem espontaneamente, especialmente em pacientes jovens. Ainda não há critérios claros moleculares ou morfológicos que sejam preditivos de evolução das NIC2, apesar das recomendações da LAST 2012 sugerir a utilização do p16 para decisão de tratar ou acompanhar as pacientes, em estudos prévios do nosso grupo não é um exame acurado. A infecção persistente por HPV de alto risco é um dos principais fatores de risco para o carcinoma escamosos do colo uterino. Visando avaliar se o tipo de HPV encontrado pode ser preditivo de evolução ou regressão espontânea de NIC, foi proposto um estudo de coorte com pacientes de NIC2 para identificar biomarcadores úteis para diferenciar o NIC2 com maior potencial regressor dos casos com maior potencial de progressão/persistência. Os casos de NIC2 foram incluídos de duas formas uma prospectiva ainda recrutando e seguindo as pacientes e uma retrospectiva com localização dos casos de NIC2 no arquivo da Coordenação diagnóstica de patologia. O diagnóstico de NIC 2 na biopsia foi definido pela concordância de pelo menos dois patologistas que avaliaram as amostras de forma independente, os casos de discordância formam definidos por diagnóstico de consenso entre três patologista avaliando o caso em conjunto. O desfecho clínico foi definido, nos casos tratados, pela análise do procedimento excisional. Os casos não tratados tiveram o desfecho definido pelo resultado das citologia, colposcopia de seguimento e/ou nova biópsia realizada por indicação do ginecologista, casos os achado de colposcopia e citologia não fossem concordantes foi considerado o achado mais grave, exceto nos casos em que foi realizado nova biópsia em que o resultado desta foi utilizada para definir o desfecho. Foi considerado como não regressão a persistência de NIC 2 ou mais no espécime histológico resultante de procedimento excisional ou de biópsia realizada por suspeita de progressão. A regressão completa foi definida pela ausência total de doença no espécime histológico de procedimento excisional ou em duas citologias e colposcopias negativas e com junção escamocolunar (JEC) completamente visível em intervalos semestrais. Casos que apresentaram lesão de baixo grau (NIC 1) foram considerados como regressão parcial. Foram incluídos 116 casos de NIC2, a media de idade foi de 33,95± 10,58. O desfecho clínico de um ano foi definido 43,9% por seguimento e 53,5% por peça de tratamento excisional. A regressão ocorreu em 49,1% dos casos (parcial-26,72% e completa-22,4%) a persistência foi observada em 33,62% e a progressão foi identificada em 13,8% dos casos. Houve perda de seguimento de 2,59% (3 casos) O DNA está sendo extraído do bloco de parafina para realização de genotipagem do HPV por amplificação por PCR e avaliação dos casos positivos por sequenciamento. 77 casos já tiveram o DNA extraído, destes 42 já foram amplificados e 13 casos foram enviados para plataforma de sequenciamento. Esta etapa do projeto ainda encontra-se em andamento. ?

Bolsista: Carolina Malheiros Araujo Silvestrini
Orientador(a): GLAUCIA DINIZ ALESSIO
Resumo: 1. JUSTIFICATIVA E RELEVÂNCIA DO PROJETO Durante o Segundo Consenso Taxonômico do T. cruzi, o parasito foi classificado em seis grupos genéticos distintos, “Discrete Typing Unitys” (DTUs), de TcI a TcVI (Zingales et al., 2009). Diversos trabalhos vêm associando a genética do T. cruzi com as características biológicas do parasito, com as manifestações clínicas da doença de Chagas e com a eficácia terapêutica do tratamento na infecção pelo T. cruzi (Toledo et al., 2003; Valadares et al., 2007; Zingales et al., 2012). Diante desse contexto, torna-se cada vez mais importante associar a diversidade genética do parasito com as técnicas utilizadas para o diagnóstico da doença de Chagas. Os métodos moleculares são os mais utilizados no diagnóstico genótipo-específico da DCh, no entanto apresentam limitações, tais como: necessidade de um conjunto de marcadores genéticos, principalmente para a identificação de infecções mistas, necessidade do isolamento prévio do parasito por métodos de baixa sensibilidade e possível seleção clonal do parasito (D´Ávilla et al., 2009; Zingales et al., 2012). Já os métodos sorológicos empregados no diagnóstico genótipo-específico da DCh não foram capazes de reconhecer todas as DTUs do T. cruzi presentes nos hospedeiros (Bhattacharyya et al., 2014). Nesse contexto, foi desenvolvida a técnica sorológica por citometria de fluxo para a pesquisa de IgG1 anti-amastigota (A), tripomastigota (T) e epimastigota (E) do T. cruzi, denominada Chagas-Flow ATE (Alessio et al., 2014, Patente BR 102014003374-2). Inicialmente, a Chagas-Flow ATE foi desenvolvida para o diagnóstico genótipo-específico da infecção experimental pelo T. cruzi, apresentando um bom desempenho para discriminar as diferentes DTUs do parasito que infectavam os camundongos. (Alessio et al., 2017, 2018). Recentemente, utilizando amostras de soros de humanos, foi demonstrado que a Chagas-Flow ATE apresentou uma excelente acurácia (100%) no diagnóstico universal e genótipo-específico da DCh para discriminar as infecções pelas DTUs “TcI x TcVI x TcII” (92%) e “TcI x TcII” (97%) (Alessio et al., 2020). Tendo em vista que hospedeiros infectados por diferentes DTUs do T. cruzi apresentam uma susceptibilidade distinta ao tratamento etiológico da DCh, a validação e completo desenvolvimento da Chagas-Flow ATE será de extrema importância em estudos futuros de monitoração pós-terapêutica em pacientes portadores da doença de Chagas. 3. OBJETIVO GERAL Avaliar o desempenho da técnica Chagas-Flow ATE na monitoração pós-tratamento da doença de Chagas. 3.1. Objetivos específicos 1- Avaliar a reatividade de amostras de soros de pacientes infectados com diferentes DTUs do T. cruzi antes e 10 anos após o tratamento, por meio da técnica Chagas-Flow ATE. 2- Avaliar o desempenho dessa nova metodologia por meio de análises estatísticas. 4. METODOLOGIA O procedimento experimental da Chagas-Flow ATE será realizado como descrito previamente por Alessio et al. (2020). Esse projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética do Instituto René Rachou/Fiocruz MG (C.A.A.E: 26890014.6.0000.5091, número do protocolo #3.055.734). A metodologia será realizada nas seguintes etapas: 1) Seleção dos soros que serão testados na Chagas-Flow ATE. Serão utilizadas 60 amostras de soros, sendo 30 de pacientes infectados com TcI e 30 com TcII, antes do tratamento e 10 anos após o tratamento, de ambos os sexos, com idade acima de 18 anos. Serão testadas 20 amostras de soros de indivíduos não infectados pelo T. cruzi. As amostras de soros já foram coletadas e se encontram armazenadas à -80°C. 2) Cultivo e preparação das formas amastigotas (AMA) + tripomastigotas (TRIPO) em cultura de células L929, e de epimastigotas (EPI) do T. cruzi em meio acelular “Liver Infusion Tryptose” (LIT). A suspensão de EPI será fixada com solução fixadora para citometria de fluxo (MFF). Serão cultivados as três formas evolutivas do parasito das DTUs TcI (cepa Colombiana) e TcII (cepa Y) para serem utilizadas como antígeno na Chagas-Flow ATE. As formas tripomastigotas e amastigotas não serão cultivadas pela bolsista. 3) Realização da sorologia Chagas-Flow ATE e leitura na citômetro de fluxo FACScalibur. As formas amastigotas e tripomastigotas vivas e epimastigotas fixadas dos diferentes genótipos serão marcadas com isotiocianato de fluoresceína (FITC). Após a marcação essas formas evolutivas serão misturas em proporções equivalentes. Em placas de 96 poços de fundo em U, os soros diluídos (1:1000 a 1:32.000) serão incubados com os antígenos AMA/TRIPO/EPI a 37°C por 30 min. Posteriormente, será realizada a incubação com o anticorpo humano anti-IgG1 biotinilado junto com a estreptoavidina conjugada com a ficoeritrina a 37°C por 30 min. No final do experimento, os parasitos serão fixados com de MFF e será realizada a leitura no citômetro de fluxo FACScalibur. O bolsista irá acompanhar os experimentos e auxiliar nas etapas que não envolvam a manipulação das formas tripomastigotas e amastigotas vivas do T. cruzi. 4) Realização das análises no “FlowJo” e de análises estatísticas no “Graph Pad Prism”.

Bolsista: GLEICYANE SILVA GOMES
Orientador(a): REGINA CELIA BRESSAN QUEIROZ DE FIGUEIREDO
Resumo: JUSTIFICATIVA E RELEVÂNCIA: A doença de Chagas (DC), causada pelo protozoário Trypanossoma cruzi, é uma doença que causa distúrbios cardíacos e digestivos severos em humanos, os quais muitas vezes levam ao óbito. A cardiomiopatia chagásica crônica (CCC), é a mais frequente e severa das formas da DC, e uma das principais causas de morbidade e mortalidade devido a complicações cardiovasculares e falência do órgão. A CCC é resultado de uma baixa, mas persistente miocardite focal associada a um processo inflamatório crônico e um desequilíbrio na relação T. cruzi-célula hospedeira. O sucesso da infecção dos cardiomiócitos pelo T. cruzi depende, entre outros fatores, da forma como o parasita reconhece e explora organelas e vias metabólicas dos hospedeiros para estabelecer um ambiente favorável à sua sobrevivência e disseminação no organismo. Dentre as organelas mais exploradas por patógenos, o Retículo endoplasmático (RE) assume um papel de destaque pelo seu papel na síntese, dobramento, modificação e transporte de proteínas. Um desequilíbrio na sua fisiologia pode levar ao acúmulo de proteínas mal dobradas referido com estresse do RE (ERE). Na tentativa de restabelecer a sua função e diminuir o estresse, o RE lança mão da UPR (unfolded protein response), uma resposta adaptativa essencial para restabelecer a funcionalidade da organela. No entanto, o ERE persistente pode ativar processos inflamatórios e a morte da célula hospedeira. Dentro da premissa que a associação de T. cruzi com organelas intracelulares pode determinar o sucesso ou não da infecção, bem como o destino das células hospedeira, estratégias que inibam estas interações, podem ser um caminho terapêutico para tratamento da CCC. Sabe-se que cardiomioblastos infectados por T. cruzi, sofrem ERE e ativam a UPR nestas células. No entanto, as consequências destas interações ainda não foram totalmente elucidadas. O ácido tauroursodesoxicólico (TUDCA) é um potente inibidor do ERE, prevenindo as consequências prejudiciais da UPR quando este se torna persistente. Apesar do seu potencial citoprotetor em vários modelos, nos quais o dano e morte celular resulta de um ERE persistente, o efeito deste inibidor sobre a infecção de células cardíacas por T. cruzi ainda não foi investigado. OBJETIVOS: No presente trabalho, visamos identificar moléculas que possam inibir vias ou organelas que favorecem a sobrevivência de T. cruzi em cardiomioblastos, bem como investigar a interação deste parasito com o RE, durante o curso da infecção. METODOLOGIA: Para avaliar o efeito do inibidor de estresse do RE sobre as células infectadas com T. cruzi, cardiomioblastos serão infectadas com formas tripomastigotas e incubadas na presença ou ausência de diferentes concentrações do TUDCA. As células serão então fixadas e coradas com Giemsa, para determinação da porcentagem de células infectadas e a intensidade de infecção, através da microscopia óptica. Cardiomioblastos infectados e não tratados serão usados como controle. O tratamento prévio com TUDCA será feito para avaliar o seu efeito citoprotetor sobre os cardiomioblastos. Usaremos sondas fluorescentes específicas para RE, mitocôndria e gotas lipídicas para visualizarmos a interação de T. cruzi com estas organelas durante o tratamento com o TUDCA. Para identificação efeitos dos diferentes tratamentos sobre a ultraestrutura das células as amostras serão processadas para microscopia eletrônica de transmissão e varredura. PERSPECTIVAS: Tendo em vista os danos causados pela infecção do T. cruzi, esperamos aumentar nossos conhecimentos sobre a interação parasito-célula hospedeira, com ênfase no RE. Os resultados deste estudo poderão dar suporte científico para o desenvolvimento de novas drogas que inibam o ERE persistente induzido pelo T. cruzi contribuindo para uma maior sobrevida dos cardiomioblastos, e favorecendo uma resposta efetiva contra o T. cruzi.