Revista Eletrônica do Programa de Bolsas - Edição ZERO

Bolsista: Ana Luiza Barbosa Godart Cavalcante
Orientador(a): SOLANGE LISBOA DE CASTRO
Resumo: A doença de Chagas, também conhecida como tripanossomíase americana, é uma zoonose que tem como agente etiológico o protozoário hemoflagelado Trypanosoma cruzi (Chagas, 1909). O curso clínico desta enfermidade compreende duas fases distintas: aguda e crônica. A fase aguda é caracterizada pela alta parasitemia e inespecificidade dos sintomas, o que pode acarretar no tratamento inadequado e consequente evolução da doença para a fase crônica indeterminada, período em que os pacientes permanecem assintomáticos. Aproximadamente 30-40% dos pacientes progridem para a forma crônica sintomática, fase da doença definida pela redução da parasitemia e pelo desenvolvimento de manifestações clínicas cardíacas, digestivas ou ambas (Junior, 2017). A quimioterapia para a doença de Chagas consiste na administração de Benznidazol (Bz), um nitroimidazol que possui atividade tripanocida contra todas as formas evolutivas do parasito (Coura & Castro, 2002; Junior, 2017). O Bz é uma pró-droga que, para desempenhar seus efeitos citotóxicos, precisa ser ativada por enzimas denominadas nitroredutases. As nitroredutases podem ser divididas em dois grupos: o tipo I, uma proteína dependente de NAD(P)H caracterizada por ser oxigênio-insensível e catalisar a redução de dois elétrons do grupo nitro, levando à produção de metabólitos que promovem dano ao DNA; e o tipo II, que é sensível ao oxigênio e medeia a redução de um elétron do grupo nitro, gerando um radical nitro instável que, na presença de oxigênio, reage com essa molécula e produz superóxido (Wilkinson, 2011). Além das limitações que o fármaco apresenta, a existência de cepas de T. cruzi naturalmente resistentes ao Bz pode explicar as baixas taxas de cura da doença de Chagas (Filardi, 1987; Junior, 2017). Diferenças na suscetibilidade do parasito às drogas tripanocidas vêm sendo correlacionadas às DTUs (Toledo, 2003). A redução da atividade de nitroredutases, e consequente diminuição da metabolização de compostos nitro-heterocíclicos, é um dos mecanismos que vêm sendo propostos para a resistência aos fármacos (Wilkinson, 2008; Díaz-Viraqué, 2018). Diante de uma quimioterapia limitada, a combinação de fármacos surge como alternativa para contornar o problema de falha terapêutica. A associação de medicamentos com efeito sinérgico pode resultar em maior eficácia do tratamento, redução da resistência e dos efeitos colaterais (Trinconi, 2014). Nosso grupo tem focado no estudo de tratamentos alternativos para a doença de Chagas, em especial na atividade tripanocida de naftoquinonas e derivados. Compostos naftoimidazólicos N1, N2, N3 e N4 foram estudados e mostraram relação com a disfunção mitocondrial, levando à produção de ROS e morte dos parasitos in vitro (Menna-Barreto, 2009; Bombaça, 2021). A combinação de Bz a esses compostos pode ser estudada como uma estratégia para lidar com as limitações do atual tratamento. Apesar do Benznidazol ser o fármaco de escolha para a doença de Chagas, devido a sua alta toxicidade e taxa de cura limitada, a droga é considerada longe do ideal e sua prescrição ainda é controversa (Junior, 2017). A existência de cepas de T. cruzi naturalmente resistentes ao nitroderivado é um importante fator que pode explicar os diversos casos de falha terapêutica (Filardi, 1987; Junior, 2017). Diante desta problemática, compreender o que leva o parasito em determinados casos não responder ao Bz é importante para auxiliar no tratamento dos pacientes chagásicos. Nesse sentido, o presente trabalho tem como objetivo realizar um estudo in vitro da resistência e falha terapêutica de Bz, analisando a relação entre as seis DTUs e a suscetibilidade/resistência natural ao fármaco, o papel das nitroredutases na resistência do parasito e desenvolver ensaios de combinação de drogas com a finalidade de contornar a falha terapêutica.

Bolsista: RAYANI DE OLIVEIRA MARCONDES
Orientador(a): RUBEM FIGUEIREDO SADOK MENNA BARRETO
Resumo: O Aedes aegypti é um mosquito pertencente à ordem Diptera: Culicidae, proveniente da África (KAMAL et al., 2018). Essa espécie atua como vetor de diferentes arboviroses com grande importância para a saúde pública, dentre elas dengue, febre amarela, chikungunya e zika, as quais causaram diversos surtos nas populações humanas nas últimas décadas (McGregor, 2020). Strigomonas culicis é um protozoário monoxênico, pertencente à família Trypanosomatidae (Euglenozoa: Kinetoplastea) que apresenta um ciclo de vida exclusivamente na forma epimastigota. Este tripanossomatídeo habita o intestino médio de diferentes mosquitos, dentre os quais está o A. aegypti. Os tripanosomatídeos monoxênicos possuem ciclo de vida exclusivo em hospedeiros invertebrados, principalmente dos insetos da ordem Diptera e Hemiptera (Wallace, 1966), as vias de transmissão destes protozoários entre os insetos ocorre através da ingestão, coprofagia, necrofagia e/ou predação (Maslov et al., 2013), e na maioria dos casos os tripanossomatídeos são considerados não-patogênicos para seus hospedeiros. Tendo em vista que as arboviroses de importância médica vêm sendo estudadas para maior elucidação da sua interação com o hospedeiro, e que as estratégias utilizadas para o controle da propagação e transmissão desses arbovírus são insuficientes, faz-se necessário o estudo de novas estratégias de controle biológico. Estudos anteriores do nosso grupo demonstraram que a infecção por S. culicis (cepas WT e WTR: H2O2-resistente) causam um impacto na postura e produção dos ovos, reduzindo ambos parâmetros pelas fêmeas de A. aegypti. A cepa WTR exacerba a expressão de moléculas do sistema imune do mosquito relacionadas à resposta antiviral (Bombaça et al., 2021). Dessa forma, é possível que a infecção prévia com WTR gere uma resposta antiviral mais intensa. Pretendemos avaliar o impacto da coinfecção entre as cepas selvagem ou H2O2-resistente de S. culicis com os arbovírus CHIKV, DENV e ZIKV in vitro e in vivo.

Bolsista: Anna Letícia Almeida de Alvarenga Soares
Orientador(a): CARLOS EDUARDO CALZAVARA SILVA
Resumo: Até o momento não existe um tratamento específico para a dengue, sendo este apenas paliativo. Assim, estudos que busquem alvos para o desenvolvimento ou reposicionamento de fármacos, visando uma terapia específica, são essenciais. Durante a replicação do Dengue virus (DENV) as vias de lipofagia são ativadas e, com isso, triglicérides armazenados em corpúsculos lipídicos são degradados e ácidos graxos são liberados, promovendo, através da ?-oxidação, a geração de ATP necessário para completar a multiplicação viral. Por esse motivo tais vias metabólicas devem ser exploradas como potencial alvo para o desenvolvimento de estratégias antivirais. Nosso grupo de pesquisa realizou análises transcriptômicas de hepatócitos infectados com DENV-2. Essas análises revelaram genes diferencialmente expressos que são descritos como participantes de processos biológicos envolvidos no metabolismo lipídico. Dentre esses genes foi identificado o receptor adrenérgico alfa 1 (ADRA1). ADRA1A são receptores que atuam na mediação do sistema nervoso simpático envolvidos na regulação da lipofagia e na estimulação da ?-oxidação de ácidos graxos. Devido ao exposto esse trabalho pretende avaliar a relação do ADRA1A na replicação do DENV utilizando antagonistas desse receptor, com o objetivo de validar o ADRA1A como potencial alvo para terapia específica contra a dengue e identificar fármacos candidatos ao reposicionamento. Antagonistas de ADRA1A serão identificados na plataforma DRUGBANK e serão selecionados aqueles aprovados para uso em humanos e comercializados no Brasil. Após, o CC50, IC50 sobre as partículas virais e o IS serão determinados. Para o CC50, células AML12 e Vero serão expostas a diferentes concentrações de cada antagonista e a viabilidade celular será avaliada por MTT. Para o IC50, células serão infectadas com DENV seguidas de exposição a distintas concentrações dos antagonistas seguido de titulação viral por RT-qPCR, e determinação do IS. Depois, o efeito dos antagonistas sobre a replicação do DENV será avaliado quando adicionados às culturas celulares antes e após a infecção com o DENV e em dose única ou diária. Após cinco dias será realizada a titulação viral por RT-qPCR e por unidades formadoras de placas (UFP) e avaliação da viabilidade por MTT. Ainda, será realizada a quantificação de ácidos graxos livres, corpúsculos lipídicos e de ADRA1A em AML12 infectadas com o DENV e expostas aos antagonistas. Posteriormente, camundongos serão infectados com DENV e tratados com o antagonista selecionado nos ensaios in vitro. Após cinco e onze dias de tratamento será feita coleta de sangue para análises hematológicas, titulação viral por RT-qPCR e ELISA para investigar os níveis de IgM e IgG anti-DENV. Ainda, após onze dias o fígado e rins serão removidos para titulação viral por RT-qPCR e análises histológicas. Devido a pandemia de COVID-19 o trabalho os alunos de Iniciação Científica estavam impossibilitados de comparecer na instituição e, portanto, de realizar atividades presencias. Sendo assim, nos meses iniciais dessa bolsa, foram realizadas atividades de treinamentos virtuais de biossegurança e boas práticas de laboratório, além de reuniões virtuais do grupo de pesquisa. Também, durante o regime remoto, foi realizada revisão bibliográfica. Com o retorno presencial foram realizados treinamento de preparo de meio e soluções, cultivo celular, multiplicação e titulação do DENV e, até o momento, foram estabelecidas culturas das linhagens C6/36, Vero e AML12 que serão usadas nos ensaios futuros.

Bolsista: CIBELE CARINE SILVA
Orientador(a): Valéria Pereira Hernandes
Resumo: 1 JUSTIFICATIVA/RELEVÂNCIA A Leishmaniose Tegumentar (LT) é uma doença negligenciada, considerada grave problema de saúde pública no Brasil e no mundo (OMS, 2019). Em Pernambuco, a LT é incidente em todo o estado, sendo predominante na Zona da Mata, com cerca de 65% dos casos registrados (FERREIRA, 2018). Uma das formas de controle é o diagnóstico precoce, porém os métodos atuais apresentam limitações, variando no desempenho (BRITO, 2020). Diante disso, a citometria de fluxo (CF), mediante a utilização de antígenos molecularmente definidos, destaca-se como uma alternativa promissora para um diagnóstico mais eficiente e preciso da LT. 2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS a) Obter os antígenos recombinantes de Leishmania (Viannia) braziliensis; b) Otimizar o protocolo dos ensaios de CF com o uso dos antígenos recombinantes; c) Avaliar a aplicabilidade da CF na identificação de pacientes portadores de LT ativa; d) Comparar performance dos testes de CF e ELISA, utilizando antígenos recombinantes, na detecção de portadores de LT ativa; e) Verificar a presença de reações cruzadas na CF utilizando amostras de pacientes com doenças que assemelham-se clinicamente à LT, e pacientes com Leishmaniose Visceral e Doença de Chagas 3. METODOLOGIA O estudo utilizará amostras de sangue de pacientes com LT ativa, residentes de áreas endêmicas para a doença em Pernambuco (n=30). Para a análise de reações cruzada serão utilizadas amostras de leishmaniose Visceral(n=30) e doença de Chagas (n=10). Os soros serão obtidos a partir da centrifugação do sangue coletado, inativados, e o sobrenadante será aliquotado e armazenado. Para o ELISA, será obtida a fração solúvel dos antígenos de L. (V.) braziliensis. A placa será sensibilizada com 100?L dos antígenos, e lavada com PBSTween20. Aos poços,serão adicionados 100?L do soro na diluição de 1:900. Em seguida, serão adicionados 100?L de anti-IgG humana conjugada, a placa será lavada e serão adicionados 150?L do cromógeno (OPD). Por fim, a reação será parada com 100?L de NaOH, e a leitura realizada. Para o acoplamento das proteínas recombinantes 0750 e 1140 (TAVARES, 2017) e da proteína quimérica PADRE (OLIVEIRA B.C., 2020) às partículas esféricas de poliestireno, serão adicionadas em um tubo 100?L das partículas e da proteína recombinante, e 1,8mL de PBS, deixados sob agitação. A misturá será centrifugada, e o sobrenadante será aliquotado e ressuspenso. O ensaio de CF será realizado para pesquisa de anticorpos anti-proteínas recombinantes de L. (V.) braziliensis. Em uma placa de 96poços fundo “U”, será adicionado as amostras de soro na diluição seriada(1:100 a 1:12800), e 20?L do produto do acoplamento (beads e proteínas recombinantes) e a placa será incubada. Posteriormente, serão adicionados 20?L do anti-IgGhumano conjugado, diluído na concentração de 1:200. Por fim, os sedimentos serão passados para tubos de citometria. Aquisições e análises serão realizadas em um citômetro de fluxo FACSCalibur. A análise estatística será realizada com os programas GraphPad PRISM e Flowjo. 4 CRONOGRAMA ETAPAS 2022 2023 1° 2° 1° Pesquisa bibliográfica X X X Ensaios de ELISA X X Ensaios de Citometria de Fluxo X X Análise dos resultados X X Conclusão do artigo para publicação X Elaboração do relatório final X 5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ARONSON,N.E. et al. Cutaneous leishmaniasis:Updatesin diagnosis and management. Infectious Disease Clinics, v33, n.1, p. 101-117, 2019. DE BRITO,R.C.F. Recent advances and new strategies in Leishmaniasis diagnosis.Applied BRASIL.Manual de Vigilância da Leishmaniose Tegumentar Americana.Editora do Ministério da Saúde, 2017. TAVARES, et al. Avaliação da citometria de fluxo no diagnóstico das leishmanioses utilizando antígenos recombinantes. 114.Tese– Instituto Aggeu Magalhães, 2017.

Bolsista: RAYANNE CRISTINA DA SILVA SANTOS
Orientador(a): DEBORA INACIO LEITE FIRMINO MARINHO
Resumo: Os tratamentos recomendados para o vírus da imunodeficiência humana (HIV) baseiam-se em uma combinação de fármacos antirretrovirais. Uma das principais classes de medicamentos são os Inibidores da transcriptase reversa não nucleosídeos (ITRNN) que apresentam elevada atividade antirretroviral, alta seletividade e toxicidade moderada. Um exemplo desta classe é a delavirdina (DLV), a qual exibe o núcleo indólico como um importante fragmento farmacofórico para a sua atividade anti-HIV-1. Analisando a estrutura química da da DLV, observa-se também a presença do grupo arilsulfonamida, que demonstrou importante papel na atividade antirretroviral de fármacos da classe dos inibidores de protease e nos inibidores do capsídeo do HIV-1. No entanto, a baixa barreira genética da DLV às mutações, pode induzir à resistência medicamentosa. Além disso, apesar dos excelentes resultados alcançados com o uso da DLV na terapia antirretroviral, ela foi descontinuada devido à alta quantidade de comprimidos necessária diariamente e severos efeitos adversos. Este fármaco também mostrou-se menos eficaz frente às cepas mutantes, quando comparado com os ITRNN disponíveis. Com isso, visando obter melhores perfis de resistência, os novos ITRNN devem ser projetados com estruturas flexíveis, para que as mutações pontuais não possam interromper suas interações com a bolsa de ligação ao fármaco. O objetivo deste trabalho é a síntese, caracterização e avaliação das atividades antirretrovirais e citotóxicas de novos potenciais ITRNN, baseados na estrutura química da DLV. Esses novos potenciais ITRNN foram planejados baseados em compostos que apresentem em sua estrutura química, importantes grupos farmacofóricos para a inibição do HIV-1, como a DLV e a isatina, amplamente explorada pelo nosso grupo de pesquisa e com comprovada atividade antirretroviral. Os novos compostos serão sintetizados através de uma rota sintética convergente, composta por seis etapas reacionais. Adicionalmente, serão realizados estudos de docking molecular para definir o modo de ligação dos ITRNN.

Bolsista: MARIA DE FÁTIMA SCHUENGUE BASTOS
Orientador(a): MELISSA QUERIDO CARDENAS ROSSAS
Resumo: Apesar do recente aumento de pesquisas sobre a biodiversidade, os parasitos constituem um grupo negligenciado, embora desempenhem um papel chave no funcionamento dos ecossistemas. A compreensão do papel da comunidade de parasitos em um ecossistema depende do conhecimento prévio das espécies que o compõem. Deste modo, estudos taxonômicos e sistemáticos são a chave para o entendimento de como fatores bióticos e abióticos afetam as espécies. Estudos taxonômicos são críticos, pois para muitas espécies há um risco de extinção antes que elas sejam descobertas e descritas. O rio Tocantins pertence à Bacia Tocantins-Araguaia, e é uma área de endemismo para vários grupos de peixes de água doce, como identificado por vários autores. Este rio vem apresentando modificações nas últimas décadas decorrentes da ação antrópica que degrada não só o leito principal do rio, mas também seus afluentes. Esta bacia é uma das regiões hidrográficas mais importantes do Brasil, pelo seu alto grau de endemismo e diversidade. O rio Juruá está situado no estado do Acre, e pertence à bacia Amazônica. Apesar desta bacia abrigar a mais alta diversidade de peixes de água doce do mundo, dados do Zoneamento Ecológico-Econômico – ZEE contabilizam aproximadamente 310 espécies de peixes catalogadas para o estado. Acredita-se que a ictiofauna desta área seja pouco conhecida devido ao seu isolamento geográfico e distância dos principais centros de estudos ictiológicos do país. A parte inicial do projeto que corresponde à coleta e necropsia dos peixes hospedeiros para obtenção dos Nematoda, já havia sido realizada antes da pandemia. Como não estava sendo possível ir presencialmente ao Laboratório de Helmintos Parasitos de Peixes (LHPP), as necrópsias dos hospedeiros já coletados no Acre foram organizadas em tabelas do Excel e foi feito um levantamento bibliográfico dos Nematoda registrados anteriormente nesses hospedeiros. Todos os artigos científicos foram salvos, formando um banco de dados que servirá como suporte para posterior análise e discussão de nossos dados. Além disso, foram realizados encontros semanais através do Google Meet com a equipe do laboratório, visando a discussão e apresentação de assuntos pertinentes que fazem com que possamos ler artigos científicos, preparar seminários e aprender com outras apresentações. Com o retorno das atividades presenciais a identificação de espécies de Nematoda previamente coletadas foi iniciada. Foram analisados os Nematoda provenientes de Triportheus trifurcatus do Rio Tocantins, Maranhão. Esses Nematoda foram identificados como Rhabdochona sp. Como perspectivas futuras, os estudos morfométricos dos espécimes serão aprofundados, e outras espécies de Nematoda serão identificadas. Rhabdochona sp. está sendo registrado pela primeira vez em T. trifurcatus, contribuindo assim para um maior conhecimento da helmintofauna da Bacia Tocantins-Araguaia.