Revista Eletrônica do Programa de Bolsas - Edição 1

Bolsista: Ingrid Bernardes Antero
Orientador(a): MARIA HELENA FERES SAAD
Resumo: A Tuberculose (TB) é uma doença infectocontagiosa que compromete a saúde pública mundial, pois é a primeira causa de morte entre as doenças infecciosas. Seu manejo segue desafiador, em especial na faixa etária pediátrica, devido ao caráter paucibacilar da doença nesta população, o que dificulta visualizar e isolar a bactéria por baciloscopia e cultura, respectivamente. O teste rápido molecular Xpert MTB/RFM® (TRM-TB) promissor possui uso limitado na TB pediátrica, pois o caráter paucibacilar, produz na TB pulmonar sensibilidade de 66 %. Os métodos diagnósticos disponíveis, que não dependem da presença do bacilo no espécime clínico, são baseados na resposta imune celular de hipersensibilidade tardia na Prova Tuberculínica (PT) e na detecção de interferon gama produzido pelas células T do periférico induzidas por antígenos específicos de M. tuberculosis (IGRAs), mas possuem limitações. A PT requer 72 hs para o resultado e apresenta baixa especificidade; os IGRAs, embora mais específicos têm baixa sensibilidade, requerem mais de 24 h para o resultado, equipamentos e profissionais especializados, não atendem a necessidade de serem testes rápidos, de fácil operacionalidade, de baixo custo e não discriminam a TB ativa da TB latente (LTBI), além de mostrarem sensibilidade limitada em crianças (particularmente nos <5 anos de idade) Assim, biomarcadores alternativos que possam atender esta demanda são necessários. Estudos prévios em adultos mostraram resposta diferenciada de IgG e seus subtipos em TB ativa e LTBI associados a diferentes antígenos micobacterianos expressos ou não na LTBI. Assim, com base na complexidade de M. tuberculosis, o agente etiológico da TB, para sobreviver no hospedeiro, será avaliado os marcadores de latência Rv2029 e Rv3353, bem como o internacional ESAT5:CFP10 como alternativa auxiliar no diagnósticos por resposta de IgG e subclasses de soros de crianças e adolescentes, com TB ativa ou LTBI e controle, utilizando o convencional método imunoenzimático em suporte sólido (ELISA).

Bolsista: STEPHANIE MEGALE FERREIRA
Orientador(a): RUBENS LIMA DO MONTE NETO
Resumo: Nas últimas décadas tornou-se claro que as práticas comuns experimentais, juntamente com um sistema de publicação que recompensa a produtividade em vez do rigor, pode nos levar a uma literatura científica que carece de confiabilidade. Nesse contexto surgiu a Iniciativa Brasileira de Reprodutibilidade (IBR), um esforço multicêntrico, cujo desafio é avaliar a reprodutibilidade da ciência biomédica brasileira. O objetivo da IBR é replicar de 50 a 100 experimentos de artigos brasileiros, dentro de uma rede nacional de colaboradores. Nosso grupo de pesquisa “Biotecnologia Aplicada ao Estudo de Patógenos” (BAP) foi selecionado para fazer parte desse projeto coordenado pela UFRJ e pelo Instituto Serrapilheira. A importância destas iniciativas de replicação tem sido demonstrada em inúmeras áreas de pesquisa. A ciência brasileira cresceu rapidamente nas últimas décadas sob pressão para aderir a padrões das agências de fomento públicas, criando um terreno abundante para fatores considerados implícitos à falta de reprodutibilidade, como uma mentalidade publicitária que incentiva o baixo rigor metodológico e científico. Os resultados não só serão fundamentais para avaliar o quão reprodutível é a ciência biomédica brasileira, como podem ativamente contribuir para diminuir o desperdício futuro de vidas animais e materiais caros em experimentos irreprodutíveis. Ao final deste estudo, nosso grupo fará parte do primeiro estudo sistemático de reprodutibilidade científica a nível nacional. 3) Objetivo Geral Reproduzir cinco experimentos de artigos brasileiros pré-selecionados pela IBR que envolvem a avaliação da toxicidade celular por agentes químicos em macrófagos murinos e medir a expressão diferencial de genes na presença de cafeína e estradiol 3.1 Objetivos específicos - Analisar a viabilidade celular, proliferação e citotoxicidade dos agentes: (+)alfa-pineno; clorexidina e de uma mistura de pesticidas organoclorados; - Avaliar a expressão relativa do gene Slc2a4 na linhagem celular de adipócitos diferenciados 3T3-L1, na presença de 17-beta estradiol; - Quantificar a expressão relativa do gene Nr1i3 em hepatócitos de camundongo C57Bl/6 que receberam cafeína por via oral 4) Metodologia 4.1. Ensaio de MTT Camundongos Swiss entre 42-56 dias de idade, serão submetidos à extração de macrófagos peritoneais, elicitados mediante injeção IP de 1 mL de tioglicolato a 3 %. Três dias após a injeção, os camundongos serão anestesiados com 80 mg/kg de cetamina e 10 mg/kg de xilazina e serão eutanasiados. As células peritoneais elicitadas serão obtidas pela lavagem da cavidade peritoneal com PBS. A viabilidade celular será acessada utilizando Azul de Tripan (4 %). Os macrófagos serão expostos aos agentes: clorexidina, (+)-alfa-pineno e a uma mistura de pesticidas organoclorados, em tempos que variam de 1 a 48 h. Depois desse intervalo será adicionado o MTT às culturas, cujo metabolização resulta em cristais de formazan (azul), diretamente proporcional à viabilidade celular. Os cristais são solubilizados na presença de DMSO e a avaliação colorimétrica permite medir a viabilidade das células. 4.2. Ensaio RT-PCR: Camundongos C57Bl/6 fêmeas com três meses de idade e pesando 22-26 g receberão ou não (grupo controle) cafeína por via oral. A cafeína será diluída em água filtrada e os animais receberão 50 mg/kg por gavagem uma vez ao dia durante 15 dias. Os controles receberam apenas água filtrada. A solução estoque de cafeína a 20 mg/mL será armazenada em temperatura ambiente. O volume de cafeína administrado para cada animal será de 0,2 mL. No 16º dia os serão eutanasiados por anestesia profunda (Thiopental 250 mg/kg). Os fígados serão colhidos para extração de mRNA, congelados em nitrogênio líquido e conservados a -80° até a extração de RNA. Após a extração o RNA total será transcrito reversamente em cDNA, para a análise de PCR em tempo real que será realizada em triplicata utilizando o termociclador ViiA7 (ThermoFisher).

Bolsista: Bruno Sousa de Almeida
Orientador(a): KARINE ARAUJO DAMASCENO
Resumo: O desenvolvimento de metástase em pacientes com câncer de mama ainda é a principal causa de morte e o enfrentamento desta fase da doença é um grande desafio para a diminuição das taxas de mortalidade. O conhecimento sobre os inúmeros mecanismos envolvidos nas etapas prévias ao processo da metástase ainda não está completamente elucidado. As interações existentes entre as células neoplásicas e o microambiente circunjacente são extremante relevantes para o curso da doença. Neste contexto, a matriz extracelular (MEC) sofre modificações induzidas pelas células cancerosas, células inflamatórias e pelas próprias células do estroma e contribui para a manutenção de um microambiente favorável à invasão e desenvolvimento de metástases. A MEC pode alterar sua constituição e sofrer remodelação antes mesmo que as etapas iniciais de progressão tenham ocorrido e, desta forma, contribuir para proliferação, migração e sobrevivência das células cancerosas. A nossa proposta tem por intuito caracterizar a constituição desta MEC, suas alterações morfológicas e correlacionar os achados com fatores prognósticos em casos de carcinomas mamários espontâneos em modelo canino com estadio avançado.

Bolsista: ITALO DE LUCAS DA SILVA XAVIER
Orientador(a): CLAUDIA MAGALHAES CALVET ALVAREZ
Resumo: Justificativa e Relevância. A fibrose intersticial é um fator determinante para as manifestações patogênicas da doença de Chagas. Ensaios clínicos mostraram forte correlação entre o percentual de fibrose tecidual e o baixo índice de fração de ejeção ventricular de pacientes com doença de Chagas 1. A única droga disponível para o tratamento da doença, o Benzonidazol, reduz a carga parasitária durante a fase crônica com eficácia variável, mas quando administrado a pacientes com cardiomiopatia avançada, não resultou em melhora do desfecho clínico2. Assim, o desenvolvimento de terapias visando o tratamento da fibrose são necessários para serem administrados em combinação com agentes tripanocidas, possibilitando uma melhora clínica significativa para cardiomiopatia avançada. Dados de fosfoproteômica do nosso grupo sugeriram a ativação das vias de sinalização DYRK2, AMPK2, NDRG2, JNK e p38 durante a infecção crônica experimental3 . Assim, nos propomos a validar esses alvos e avaliar se inibidores dessas vias podem prevenir o aumento de colágeno em modelos in vitro de fibrose cardíaca durante interação com T. cruzi. Objetivos. Investigar a fosforilação de DYRK2, AMPK2 e NDRG2 durante a interação fibroblastos cardíacos – T. cruzi; quantificar a expressão de colágeno por FC tratados com inibidores destas vias de sinalização; avaliar o papel de inibidores de DYRK2, AMPK2, NDRG2, JNK e p38 na proliferação de FC após contato com o patógeno. Metodologia. Células e parasitas- Fibroblastos cardíacos (FC) serão purificados a partir de passagens sucessivas de culturas de cardiomiócitos, como descrito anteriormente4. Serão utilizadas para as análises formas tripomastigotas de T. cruzi, cepa Brazil, derivadas de cultivo celular; Western blot –Proteínas totais de extratos de FC infectados por 48h pelo T. cruzi, ou FC estimulados com meio condicionado por parasitas ou soro de camundongos infectados serão separados por SDS-PAGE, transferidos para membrana de nitrocelulose e DYRK2, AMPK2, NDRG2, JNK e p38 fosforiladas serão detectadas com anticorpos específicos; Quantificação de colágeno- – Culturas de FC nas mesmas condições acima serão tratadas com inibidores de DYRK2, AMPK2, JNK e p38, e RNAi para NDRG2. As culturas serão fixadas e coradas com corante Sirius Red/Fast Green por 2h, o que permite a medida semiquantitativa do conteúdo de colágeno e proteínas não colágenas em cultura5. Após lavagem, o corante é extraído das células com solução de NaOH 0,1 N /Metanol 1:1. As absorbâncias dos sobrenadantes resultantes são lidas no leitor de microplacas Spectramax M2 (Molecular Devices) a ? 540 e 605 nm5; Ensaios de proliferação celular- FC serão cultivados submetidos a estimulação de colágeno (via infecção direta, ou exposição a antígenos do parasita)e tratados com inibidores da via de sinalização. A proliferação será avaliada a partir da medida de incorporação 5-bromo-2’-deoxiuridina (BrDU). Após fixação, as células serão incubadas com anticorpo anti-BrDU conjugado a peroxidase. Em seguida, o complexo antígeno-anticorpo será detectado pela adição do substrato tetrametilbenzidina (TMB) e a DO será obtida por leitura em ?450 nm em leitor de microplacas Spectramax M2 (Molecular Devices). Referências Bibliográficas. 1. Tassi EM et al Arq Bras Cardiol 102, 456 (2014). 2. Morillo C et al. N Engl J Med 373, 1295 (2015). 3. Wozniak JM et al. PLOS NEGL TROP DIS 14, e0007980 (2020). 4. Silva TA et al Int J Mol Sci 20, (2019). 5. Houghton PE et al Wound Repair and Regeneration 4, 489–495 (1996).

Bolsista: CAROLINE DE SOUZA RODRIGUES
Orientador(a): ROMULO GONCALVES AGOSTINHO GALVANI
Resumo: O câncer é uma doença heterogênea e de ocorrência multifatorial. Entre as mulheres, o tipo mais frequente é o de mama. Embora o tumor primário seja importante para o curso da doença, o responsável pelo óbito da paciente é a metástase, tornando clara a urgência do entendimento dos fatores responsáveis pela sua indução. A linhagem celular de tumor de mama murino 4T1, ortotopicamente introduzida em camundongos BALB/cJ, é altamente tumorigênica e invasiva, sendo capaz de metastatizar para os mesmos órgãos afetados pelo câncer de mama humano, incluindo ossos, pulmão, linfonodos drenantes da mama, fígado e cérebro, servindo de modelo da forma mais grave da doença. Em consequência da heterogeneidade desse carcinoma, várias linhagens parentais de 4T1 foram isoladas e possuem fenótipos metastáticos divergentes, dentre elas a 67NR, que não tem capacidade invasiva, portanto não é letal, servindo de modelo para carcinoma in situ. A análise ex vivo de linfócitos T CD4 isolados da medula óssea de camundongos inoculados com células 4T1 ou 67NR demonstrou que no grupo que recebeu células 4T1, as células T são capazes de induzir doença osteolítica precoce essencial para o estabelecimento da metástase óssea, em contrapartida o grupo que recebeu o carcinoma in situ 67NR, não apresentou a perda óssea. A atividade pró-metastática destas células T foi positivamente correlacionada com a produção de citocinas pró-osteoclastogênicas, incluindo a molécula RANKL, regulador principal dos processos de osteoclastogênese e remodelamento ósseo. Estes dados sugerem que o tumor pode exercer papel sobre a diferenciação e ativação de células T influenciando na patologia da doença. Sendo assim, o objetivo desse trabalho é analisar as características moleculares de 67NR e 4T1 para compreensão dos fatores celulares intrínsecos que sejam importantes para o estabelecimento metastático. A modulação pode ocorrer devido a moléculas que são expressas pelo tumor e agem diretamente sobre os linfócitos T, ou mesmo sobre outras células importantes na ativação dos primeiros. Para tal, utilizaremos dados depositados referentes a expressão gênica das linhagens celulares 67NR e 4T1 e buscaremos genes diferencialmente expressos (DEG) entre elas e então faremos uma busca por vias de sinalização possivelmente enriquecidas (GSEA) que estejam relacionadas com processos inflamatórios e a resposta imunológica. Para validar os achados in vitro será realizada a avaliação da expressão dos genes encontrados através de PCR em tempo real semi-quantitativo (TaqMan™). Outra possibilidade poderia ser o processamento de peptídeos a partir das proteínas de uma linhagem celular gerar respostas quantitativamente ou mesmo qualitativamente diferentes das respostas geradas para peptídeos da outra linhagem. Para avaliar esta possibilidade avaliaremos o peptidoma e ligandoma das linhagens celulares no contexto do haplótipo de MHC singeneico a ela (H2d) referente as respostas T CD4 (NetMHCIIPan) e da resposta T CD8 (NetMHCPan). Os peptídeos específicos de cada linhagem serão avaliados quanto a sua imunogenicidade através de dados depositados previamente através do Immune Epitope Database and Analysis Resource (IEDB). A identificação de tais fatores potencialmente associados ao estabelecimento metastático possibilita a compreensão da patologia da doença bem como a possibilidade de posterior validação in vivo e a geração de alternativas terapêuticas para o tratamento da metástase, atualmente inexistente

Bolsista: LARISSA MEIRA RESENDE
Orientador(a): Rosiane Aparecida da Silva Pereira
Resumo: Apesar dos avanços alcançados pelas ações de controle da esquistossomose, a doença ainda permanece como um grave problema de saúde pública mundial. Novas intervenções são uma prioridade para a eliminação e controle da esquistossomose, uma vez que as medidas atuais adotadas têm sido essencialmente baseadas na quimioterapia. Um dos obstáculos para alcançar a eliminação da doença é a sensibilidade do método de diagnóstico utilizado. Atualmente, o diagnóstico parasitológico pela técnica de Kato-Katz é o recomendado pela OMS. Entretanto, este método apresenta uma baixa sensibilidade na detecção da infecção pelo S. mansoni, principalmente em áreas de baixa endemicidade e baixa intensidade de infecção. Portanto, é urgente a necessidade de melhorias no diagnóstico da doença, sendo necessário o desenvolvimento de ferramentas alternativas, como novos testes sorológicos que sejam mais sensíveis e capazes de detectar precisamente as infecções ativas, bem como a prospecção de antígenos do parasito para serem empregados nesses testes. Em um estudo de imunoproteoma realizado pelo nosso grupo foram identificadas algumas proteínas com potencial para serem utilizadas como alvos para o diagnóstico sorológico da esquistossomose. Estas proteínas foram reconhecidas exclusivamente por anticorpos presentes no soro de indivíduos infectados, residentes em área endêmica para esquistossomose. Uma destas proteínas, que neste trabalho é chamada de PPE de S. mansoni, tem apresentado resultados promissores na forma de proteína recombinante. Para melhorar ainda mais a acurácia dos testes utilizando a proteína PPE recombinante, o objetivo deste projeto é realizar uma prospecção de peptídeos antigênicos da PPE que possam ser utilizados como alvos em novos testes de diagnóstico sorológico da esquistossomose. A estratégia experimental foi definida em dois eixos. O primeiro baseado na prospecção in sílico de peptídeos por meio do uso de diferentes preditores de epítopos de células B e o segundo, na utilização de peptídeos de 15 aminoácidos, que cobrem toda a sequência da proteína PPE, imobilizados em lâminas de vidro na forma de microarranjos de peptídeos. Os peptídeos selecionados in sílico serão sintetizados e utilizados em ensaios de ELISA para avaliar a reatividade de anticorpos presentes em amostras de soro de indivíduos infectados e não infectados pelo S. mansoni frente a estes antígenos. Os microarranjos de peptídeos também serão utilizados em imunoensaios para detecção dos peptídeos imunorreativos da proteína PPE. A realização deste projeto poderá resultar na identificação de peptídeos da proteína PPE com potencial para serem empregados em diferentes plataformas de diagnóstico sorológico da esquistossomose.