Revista Eletrônica do Programa de Bolsas - Edição 1

Bolsista: JOANA MARIA RODRIGUES SIQUEIRA
Orientador(a): MARIA LUCIANA SILVA DE FREITAS
Resumo: A imunopatogênese da leishmaniose visceral (LV) ativa é caracterizada por uma imunossupressão em paralelo a uma ativação imune sistêmica. Ambos os mecanismos podem contribuir para um comprometimento da resposta efetora específica ao parasito, impactando negativamente na evolução clínica dos pacientes. De fato, o status inflamatório exacerbado já foi associado à evolução para LV grave, onde altos níveis de citocinas inflamatórias precederam o óbito de pacientes com LV ativa, e se correlacionaram com parâmetros clínico-laboratoriais associados à gravidade. A literatura acerca dos fatores imunológicos que possam predizer tais desfechos é vasta. No entanto, as recidivas têm emergido como um desafio clínico adicional na LV e ainda pouco se investiga sobre os parâmetros imunológicos subjacentes. Nesse cenário, o grau de ativação de linfócitos T pode ser determinante para a senescência replicativa, que resulta no acúmulo de células T terminalmente diferenciadas, caracterizadas por uma deficiência na proliferação, produção de citocinas, e que podem ser identificados por marcadores fenotípicos. Assim, nossa hipótese é que o prejuízo imune da fase ativa da LV, ao lado das consequências do elevado grau de ativação, como a senescência replicativa, podem comprometer a qualidade da resposta efetora ao parasito e predispor às recidivas da LV. No contexto da coinfecção LV/HIV, nosso grupo verificou que pacientes com recidivas da LV (-R: recidivantes) mantiveram percentuais elevados de linfócitos T ativados ex vivo, diferente daqueles com primodiagnóstico da LV (-NR: não-recidivantes) que reverteram estes parâmetros a níveis próximos da normalidade. Além disso, os percentuais de células T senescentes foram elevados nos pacientes LV/HIV. Assim, acreditamos que, mesmo entre os não-coinfectados, a não-responsividade de clones específicos aos antígenos de Leishmania, em conjunto à morte celular induzida por ativação na periferia podem ajudar a explicar a perda do controle parasitário e a progressão para recidivas. Espera-se encontrar parâmetros imunológicos que possam ajudar a predizer esse prognóstico. Para confirmar tal hipótese, 30 pacientes com LV serão agrupados em -NR e -R, e acompanhados desde a fase ativa até 12 meses pós-tratamento. As células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) serão obtidas por gradiente de centrifugação em Ficoll-Hypaque, criopreservadas e, posteriormente, descongeladas para estímulo in vitro frente aos antígenos de L. infantum. Após, parâmetros fenotípicos e funcionais em termos de senescência, ativação, proliferação e produção de citocinas intracelulares serão avaliados por citometria de fluxo multiparamétrica. Os resultados mais recentes são provenientes de experimentos de padronização da estimulação in vitro com os antígenos parasitários, seguido de imunofenotipagem extracelular e intracelular para a avaliação dos perfis fenotípicos propostos. Obteve-se sucesso na padronização, sobretudo, nas análises de proliferação celular pela marcação do BrdU, que foi confirmada pelo estímulo com mitógeno Concanavalina A. Finalmente, embora o n de pacientes seja pouco expressivo, a padronização foi efetiva em relação aos demais perfis avaliados, sendo possível estabelecer uma estratégia de análise bem definida.

Bolsista: GABRIELA LOUISE DA SILVA MOREIRA
Orientador(a): CLAUDIA MAGALHAES CALVET ALVAREZ
Resumo: Justificativa e Relevância. O tratamento da doença de Chagas é limitado às drogas benzonidazol e nifurtimox, que apresentam eficácia variável na fase crônica da infecção e causam severos efeitos colaterais tóxicos. Assim, a busca por drogas mais efetivas e menos tóxicas continua sendo um desafio atual. Derivados de piperina e butenolídeos, compostos sintetizados a partir de produtos naturais, mostraram atividade tripanocida promissora e merecem avançar no pipeline de desenvolvimento de drogas1,2. Em paralelo, o composto SRPIN340 e derivados, inibidores seletivos de quinase serina-arginina 1/2, são candidatos para serem avaliados contra o T. cruzi, que possui enzimas análogas à quinase alvo dos compostos3. Esses inibidores de quinases também têm potencial de desempenhar atividade dual e proteger o miocárdio durante a infecção, já que relatos anteriores mostraram que a SRPIN340 evitou danos oxidativos em cardiomiócitos e músculo cardíaco de ratos4. Além disso, estresse oxidativo5 e a infecção pelo T. cruzi 6 levam à acumulação de matriz extracelular em fibroblastos cardíacos. Assim, o inibidor SRPIN340 e derivados também podem interferir no processo de fibrose cardíaca, condição incapacitante da fase crônica da doença de Chagas. Objetivos. Avaliar a atividade tripanocida de derivados de piperina, butenolídeos e SRPIN340; investigar se SRPIN340 e derivados protegem cardiomiócitos dos danos oxidativos causados pelo T. cruzi; analisar se SRPIN340 e derivados possuem atividade anti-fibrótica em fibroblastos cardíacos infectados pelo parasita. Metodologia. Triagem de atividade tripanocida – Formas tripomastigotas de T. cruzi Dm28c luc e células Vero infectadas pelo mesmo clone serão tratadas com derivados de piperina, butenolídeos e SRPIN340 por 24h e 72h, respectivamente, e a viabilidade dos parasitas avaliada pela adição de luciferina e leitura de luminescência7; Ensaios de washout- Culturas de vero infectadas com T. cruzi Dm28c luc serão tratadas com os compostos por 72h e depois os compostos serão removidos para avaliar a ressurgência de parasitas após 3 dias por detecção luminescente7; Análise de dano oxidativo-Culturas primárias de cardiomiócitos murinos serão infectadas e tratadas com SRPIN340 e derivados. A produção de espécies reativas de oxigênio será medida por reagente de Griess e através de microscopia de fluorescência com o corante MitoSOX Red (Invitrogen). Quantificação de colágeno- – Culturas de fibroblastos cardíacos murinos derivados de cultivo primário, infectadas pelo T. cruzi, serão tratadas com SRPIN340 e derivados. As culturas serão fixadas e coradas com corante Sirius Red/Fast Green por 2h, o que permite a medida semiquantitativa do conteúdo de colágeno e proteínas não colágenas em cultura8. Após lavagem, o corante é extraído das células com solução de NaOH 0,1 N /Metanol 1:1. As absorbâncias dos sobrenadantes resultantes serão lidas no leitor de microplacas Spectramax M2 (Molecular Devices) a ? 540 e 605 nm8; Referências Bibliográficas. 1. Franklim, T. N. et al. Molecules 18, 6366 (2013) 2. Conserva, G. A. A. et al. Phytomedicine 54, 302(2019) 3. Portal, D. et al. Molecular and Biochemical Parasitology 127, 9 (2003). 4. Huang, J. et al. Biochemical and Biophysical Research Communications 510, 97 (2019). 5. Philip, J. L. et al. Disease Models & Mechanisms 8, 1579 (2015). 6. Silva, T. A. et al. International Journal of Molecular Sciences 20, (2019). 7. Orlando, L. M. R. et al. Molecules 26, (2021). 8. Houghton, P. E. et al. Wound Repair and Regeneration 4, 489–495 (1996).

Bolsista: MARIA GABRIELA SARAH SANTOS
Orientador(a): MILENA BOTELHO PEREIRA SOARES
Resumo: A cardiomiopatia chagásica crônica (CCC) é uma doença debilitante de curso fatal, sendo as arritmias cardíacas a principal causa de morte súbita dos pacientes acometidos pela doença. Este prognóstico obscuro agrava-se em indivíduos acometidos por insuficiência cardíaca grave decorrente da CCC para os quais a única opção terapêutica definitiva é o transplante cardíaco, procedimento complexo e oneroso. No que se refere às arritmias cardíacas, estudos anteriores demonstraram que a proteína conhecida como conexina-43 (Cx43), que é o principal componente das junções comunicantes, está alterada. As alterações sofridas pela proteína ocorrem em função do processo de fosforilação em diferentes regiões dessa proteína. Essas modificações prejudicam as formações das junções comunicantes, consequentemente compromete a condução elétrica pelo coração, favorecendo o surgimento das arritmias. Em estudo anterior, foi demonstrado que a expressão de conexina 43, proteína importante para o funcionamento do sistema de condução no coração, está alterada em corações na fase crônica da doença, associada ao aumento da produção de IL-1?. O objetivo do presente projeto investigar se camundongos chagásicos crônicos tratados com inibidores de IL1B e p38MAPK apresentam alterações na localização da Cx43 cardíaca. Para isso, amostras de corações obtidas previamente serão avaliadas quanto a presença de células inflamatórias por coloração com hematoxilina e eosina, e quanto ao percentual de fibrose pela coloração com picrosírius vermelho. Além disso, a distribuição da Cx43 total e fosforilada será avaliada por imunofluorescência nos corações dos camundongos chagásicos crônicos tratados com os inibidores. O estabelecimento desse ensaio permitirá testar potenciais candidatos terapêuticos que possam contribuir para a redução das arritmias cardíacas na doença de Chagas.

Bolsista: GEANINE SOUZA ROCHA
Orientador(a): MILENA BOTELHO PEREIRA SOARES
Resumo: A doença de Chagas, zoonose causada pelo protozoário hemoflagelado Trypanosoma cruzi, afeta cerca de 6-7 milhões de pessoas no mundo, principalmente na América Latina. No Brasil e em muitos países, o tratamento dessa enfermidade se baseia na utilização do benzonidazol ou nifurtimox. Ambos os fármacos têm o seu uso associado a uma série de efeitos adversos no paciente ao longo do tratamento e uma baixa taxa de cura nos indivíduos com doença crônica. Considerando-se que o uso terapêutico dos compostos atualmente disponíveis é limitado, é necessário o desenvolvimento de novas opções terapêuticas para o tratamento da doença de Chagas. Uma classe atrativa para o desenvolvimento de novas agentes tripanocida são os complexos metálicos, em especial os contendo rutênio. Nesse sentido, pretende-se nesse projeto caracterizar o mecanismo de ação, a nível celular, de complexos de Ru(II) contendo tioamidas previamente identificados como potentes e seletivos agentes tripanocida. Com a presente investigação, pretendemos contribuir com a comunidade científica quanto à ação farmacológica de complexos Ru(II) contendo tioamidas.

Bolsista: GABRIELLA LINHARES PEREIRA
Orientador(a): HELENA LUCIA CARNEIRO SANTOS
Resumo: Amebas de vida-livre (AVLs) são protozoários, oportunista amplamente distribuídos em ambientes de água doce naturais e artificiais, no solo, em poeira e em fezes. Os gêneros Acanthamoeba, Naegleria, Balamuthia e Sappinia apresentam potencial patogênico para o homem e para outros animais. Algumas espécies causam, em última análise, infecções que culminam em quadros de meningoencefalite amebiana primária e encefalite amebiana granulomatosa (EAG) graves e altamente letais, ceratites, infecções de pele, renais e pulmonares. No Brasil, há uma carência de estudos no que diz respeito a identificação, diagnóstico, isolamento e potencial patogênico de AVLs. Estes micro-organismos são considerados carreadores de vírus, bactérias, protozoários e fungos por meio de relações transitórias ou simbióticas. Em áreas nosocomiais, AVLs são consideradas fontes veiculadoras e disseminadoras de micro-organismos patogênicos. As formas císticas são resistentes aos desinfetantes comumente utilizados na limpeza e na desinfecção de superfícies e de equipamentos hospitalares. Acanthamoeba spp é uma das principais responsáveis pelo quadro de ceratite amebianas que são causadas principalmente pelo uso de lentes de contato e seu mal manuseio, como a falta de limpeza do estojo, uso de desinfetantes a base de cloro e uso muito prolongado de lentes de plástico não lavadas. Desta forma, as AVLs representam um risco substancial à segurança humana e de outros animais, principalmente aqueles com quadros de imunossupressão. Globalmente, AVLs constituem um importante problema de saúde pública. As infecções causadas pelas AVLs são consideradas raras, mas altamente letais, em virtude da delonga do diagnóstico e da baixa eficácia das terapêuticas utilizadas. De fato, as AVLs apresentam grandes variações morfológicas de acordo com a sua fase evolutiva e o meio a que estejam adaptadas, dificultando assim a sua identificação. Notoriamente, a inexperiência profissional na identificação de AVLs atrelada a baixa sensibilidade e especificidade dos métodos de diagnóstico potencializa a subnotificação de casos. Desta forma, este projeto tem como objetivo avaliar técnicas de coloração permanentes para o diagnóstico de Acanthamoeba spp, visando padronização de um método de coloração rápido e eficaz, principalmente para o diagnóstico da ceratite amebiana.

Bolsista: CAMILLE DELFINO VIEIRA
Orientador(a): NUBIA BOECHAT ANDRADE
Resumo: A doença de Chagas é um sério problema de saúde pública. Endêmica em 21 países, ela é responsável por uma considerável morbidade e mortalidade atingindo cerca de 8 milhões de pessoas. Porém, tem se tornado uma doença grave mundialmente devido o aparecimento e o aumento de número de casos diagnosticados fora da área endêmica, como na América do Norte, Europa, Japão e Austrália. O tratamento da doença de Chagas depende do uso de apenas dois fármacos desenvolvidos na década de 1970, o nifurtimox (NF) um derivado nitrofurânico e benznidazol (BZ) um derivado 2-nitroimidazólico. Estas substâncias são efetivas somente no tratamento da fase aguda da doença, constituindo um sério problema na terapêutica, uma vez que, a maior parte dos casos é diagnosticada na fase crônica. Adicionalmente, a eficácia dos compostos varia de acordo com a área geográfica, devido às diferenças em suscetibilidade das diferentes cepas de T. cruzi aos fármacos. Além disso, a quimioterapia está associada a graves efeitos colaterais. A citotoxicidade e a genotoxicidade induzidas pelas substâncias podem limitar a dose e a duração do tratamento afetando adversamente a qualidade de vida e levando a risco de vida. Efeitos, a longo prazo, tais como, alterações do sistema imune e indução de malignidades provavelmente são devidos ao dano genético induzido pelo tratamento com o fármaco e/ou ao seu potencial tóxico, mutagênico, carcinogênico e promotor. Atualmente estima-se que menos de 1% das pessoas infectadas recebem tratamento devido à falta de evidencia robusta e políticas públicas de implementação. No Brasil, apenas o BZ é utilizado, e tais fatos justificam ainda mais a urgência na pesquisa e desenvolvimento de novas substâncias com atividade anti-chagásica. Nitroimidazol é uma das classes mais importantes frente a atividade tripanomicida devido a ampla e elevada ação. Esta característica se dá pelo grupo nitro ligado ao anel imidazólico porém, está associada também a toxicologia. Diversos grupos, inclusive o nosso busca a separação dessas duas atividades. Dando continuidade ao desenvolvimento de novos padrões moleculares para a DC, o objetivo deste trabalho é a síntese e a avaliação das atividades anti-T. cruzi e de citotoxicidade dos novos derivados 5-nitroimidazóis (1-8) e (18-20) e 2-nitroimidazóis (9-14) análogos do benznidazol. Cabe ressaltar que, a rota proposta para a síntese de ambos produtos é simples, sendo de grande relevância, já que estamos propondo substâncias para tratar doentes negligenciados. A avaliação nas formas amastigotas e tripomastigotas de T. cruzi e avaliação da citotoxicidade, mutagenicidade e genotoxicidade destes compostos, irão direcionar a contribuição destas substâncias para o perfil anti-chagásico. Neste sentido, espera-se que este trabalho contribua com a obtenção de substâncias promissoras com ação anti-T. cruzi. Até o momento foi possível alcançar a síntese dos derivados 1-8, os quais foram obtidos com bons rendimentos, os quais serão submetidos à avaliação biológica. Os intermediários 25-27, 33 e 34 também foram obtidos satisfatoriamente. As demais etapas sintéticas para a obtenção dos derivados finais (9-14) e (18-20) estão atualmente em curso.