Revista Eletrônica do Programa de Bolsas - Edição 2

Bolsista: GABRIELA MARINO KOERICH
Orientador(a): Mateus Nobrega Aoki
Resumo: O câncer de pâncreas ocupa o 13o lugar em incidência no Brasil e é o 6o lugar em mortalidade entre todos os tumores, sendo responsável por 4% de todas as mortes relacionadas ao câncer no país. Foi demonstrado que a incidência do câncer de pâncreas quase dobrou nas duas últimas décadas. O câncer de pâncreas representa mais de onze mil casos de óbitos na população geral brasileira, sendo seu tipo mais comum o adenocarcinoma ductal. A difícil detecção leva a um diagnóstico tardio do câncer de pâncreas, resultando em elevada taxa de mortalidade e em comportamento mais agressivo do tumor. Os fatores de risco não-hereditários ainda não são totalmente esclarecidos, sendo atualmente descritas associações com fumo, diabetes, obesidade e pancreatite crônica não-hereditária (INCA). Em relação a alterações genéticas e biomarcadores, destacam-se os genes KRAS, TP53, SMAD4 e CDKN2A. O estudo de biomarcadores é de grande importância para a identificação de novas moléculas para melhorar o diagnóstico, a estratificação de risco e de prognóstico tumoral, além de auxiliarem no manejo de pacientes e na melhor caracterização do câncer. Entre os biomarcadores plasmáticos, os microRNAs são considerados uma opção promissora devido à disponibilidade dessas moléculas no plasma. Além disso, já foram identificados alguns microRNAs relacionados com determinadas condições patológicas específicas do câncer de pâncreas. O objetivo deste estudo é validar atrevés de RT-qPCR em uma coorte maior dados obtidos por RNASeq a expressão diferencial dos miR-20b-3p, miR-378a-3p e miR-215-5p plasmáticos em pacientes com câncer de pâncreas e doadores saudáveis. Com isso poderemos observar se estas moléculas possuem potencial de biomarcadores plasmáticos em câncer de pâncreas que possam auxiliar diagnóstico e prognóstico da doença.

Bolsista: GUILHERME HENRIQUE RODRIGUES MATTOS
Orientador(a): Luzia Helena Carvalho
Resumo: A invasão dos eritrócitos pelos parasitos da malária garante o sucesso da infecção humana e, consequentemente, o desenvolvimento da doença clínica. Para que o merozoíto do P. vivax consiga sucesso nesse processo de invasão é necessária a interação entre a região II da Duffy binding protein (DBPII) e seu receptor presente na superfície dos eritrócitos, o antígeno de grupo sanguíneo Duffy receptor para quimiocinas (DARC). Logo, indivíduos que não apresentam o DARC em seus eritrócitos são altamente resistentes à infecção pelo P. vivax. Entretanto, estudos recentes demonstraram alguns indivíduos DARC negativos infectados por este parasito, o que sugere uma via alternativa de invasão ainda desconhecida. Neste contexto, o presente estudo visa caracterizar molecularmente uma proteína recém descrita do P. vivax, denominada proteína de ligação ao eritrócito 2 (EBP2), que compartilha domínios chave com a DBPII. A nossa hipótese aqui é a de que esta proteína pode participar na invasão do P. vivax em eritrócitos DARC negativos. DNAs provenientes de pacientes infectados com o P. vivax, de várias regiões do Brasil (Amapá, Amazonas, Mato Grosso, Rondônia e Pará) foram utilizados como molde para amplificar o gene da EBP2 e da DBPII por meio da técnica de Semi-Nested PCR e PCR convencional, respectivamente. As amostras amplificadas foram purificadas por meio da enzima ExoSAP-IT, dosadas no nanodrop e, aquelas com uma concentração de pelo menos 50 ng/uL foram utilizadas para o sequenciamento de Sanger. As sequências foram analisadas e comparadas com a sequência referência disponível no GenBank (acesso em ebp: K987954.1; dbp: M61095.1) para identificação de possíveis polimorfismos nos genes da EBP2 e da DBPII. Até o presente momento 10 amostras foram amplificadas, nas quais foram identificados 13 polimorfismos não-sinônimos para o gene da EBP2 e 17 para a DBPII. Os resultados iniciais sugerem que o gene da EBP2 é menos polimórfico que o da DBPII. Visando aumentar o número de amostras, já iniciamos o sequenciamento de cerca de 20 amostras, incluindo de diferentes áreas geográficas. Este estudo da variabilidade genética da EBP2 é pioneiro no nosso meio e poderá fornecer os subsídios para validar vacinas que visam proteínas menos polimórficas.

Bolsista: JULIA XAVIER PARREIRA
Orientador(a): JOB DOMINGOS INACIO FILHO
Resumo: Passados quase 80 anos desde a implementação dos antimoniais pentavalentes para o tratamento das leishmanioses, pouco se progrediu no desenvolvimento de outras terapias para essas enfermidades. De modo geral, o tratamento atual apresenta elevada toxicidade, é administrado por via intramuscular em longos esquemas terapêuticos que geram um grande desconforto para o paciente. Esses fatores contribuem para o abandono do tratamento e podem levar a registros de falha terapêutica e ao surgimento de cepas resistentes. Dentro desse cenário, é de extrema importância que haja novos estudos que contornem essas problemáticas. A busca por uma nova entidade química (NEQ) é realizada através da triagem de compostos que apresentem relevantes propriedades farmacológicas. Nesse contexto, flavonoides vêm se destacando por seus efeitos anti-inflamatórios, antimicrobianos, antifúngicos, antiparasitários e outros. A partir disso, são realizados uma série de estudos pré-clínicos para determinar a sua atividade in vitro e em modelo animal para, então, seguir para os estudos clínicos que irão avaliar a segurança e eficácia desses compostos em humanos. Caso a NEQ obtenha sucesso nessas etapas, ela é licenciada para uso clínico. Esta abordagem é amplamente válida, entretanto, como as leishmanioses são consideradas Doenças Tropicais Negligencias (DTN), não há um grande interesse das indústrias farmacêuticas para o combate dessas enfermidades, uma vez que dos 850 novos produtos registrados entre os anos de 2000-2011, apenas 97 (4%) foram indicados para esse grupo de doenças. Dessa forma, para complementar a busca por uma NEQ, paralelamente, seguiremos com a estratégia de reposicionamento de fármacos. O reposicionamento de fármacos torna-se atrativo a partir do ponto da alta demanda de tempo e dinheiro necessários para a aprovação de um composto. Esse estudo pode ser definido como o redirecionamento de um medicamento já administrado na clínica, recolocando-o para o tratamento de outra doença. Isso permite avançar algumas etapas de desenvolvimento, economizando tempo, dinheiro e acelerando a busca por novas alternativas terapêuticas para as leishmanioses. A utilização de ferramentas computacionais tem se tornado um grande aliado para a busca por novos compostos, especialmente no caso de DTN. Ferramentas como a triagem virtual baseada na docagem molecular permitem uma seleção criteriosa e racional de compostos e provêm um grande ganho para o entendimento da interação entre o ligante e a enzima alvo. Vias metabólicas são essenciais para a sobrevivência de parasitos do gênero Leishmania. Essas vias permitem a sobrevivência desses patógenos nas condições extremas no interior das células do hospedeiro vertebrado. Dessa forma, a seleção de enzimas envolvidas nessas vias revela uma excelente opção para estratégias racionais no desenvolvimento de novas terapias para as leishmanioses. No nosso estudo, utilizaremos enzimas essenciais para o controle redox de tripanosomatídeos (tripanotiona sintetase, tripanotiona peroxidase, ascorbato peroxidase e tripanotiona redutase) para uma triagem baseada no alvo, utilizando bibliotecas de de flavonoides e fármacos licenciados pelo FDA como banco de ligantes para a seleção racional de possíveis candidatos promissores para o tratamento das leishmanioses. Assim, selecionaremos, através de metodologias in silico, compostos que sejam possíveis inibidores dessas enzimas e disponíveis para tratamento por via oral. Em seguida, caracterizaremos o seu efeito in vitro em promastigotas de Leishmania spp. e determinaremos a sua segurança em macrófagos peritoneais murinos e eficácia em amastigota intracelular. Então, estudaremos o mecanismo molecular de ação e o mecanismo de ação desses compostos, bem como o seu efeito in vivo modelo murino experimental de leishmaniose. Ao final do estudo, pretendemos selecionar de forma racional compostos eficazes e seguros que possam se tornar potenciais candidatos ao tratamento oral das leishmanioses.

Bolsista: THAMIRES FELIX DOS SANTOS
Orientador(a): Osvaldo Pompilio de Melo Neto
Resumo: Justificativa e relevância Leishmania spp são parasitas protozoários que causam a leishmaniose, doença grave que ameaça cerca de 350 milhões de pessoas em todo o mundo, das quais 12 milhões são diretamente afetadas. A leishmaniose exibe uma ampla gama de sintomas clínicos, desde lesões cutâneas até mais graves como leishmaniose visceral (LV) e pode afetar tanto humanos como outros mamíferos como os cães, considerados os principais reservatórios da doença. Em sua maioria, os métodos disponíveis atualmente para o diagnóstico da LV no Brasil são laboriosos, caros, dependentes de equipamentos sofisticados para o seu funcionamento (PCR e ELISA) e/ou podem ter sua eficiência questionada. Por isso a produção de novos testes alternativos de diagnóstico eficientes, de fabricação nacional e de fácil utilização nas áreas endêmicas, contribuiria de forma significativa para a avaliação e monitoramento da LV, além de aumentar o retorno desse diagnóstico para a população afetada. Logo, o projeto busca a avaliação de antígenos previamente descritos pela equipe proponente e que tem potencial para melhorar o desempenho do diagnóstico da LV no Brasil. Objetivos Otimizar a expressão de novos antígenos recombinantes previamente identificados de L. infantum (rLci6 e rLci8) Purificar os antígenos recombinantes com alto grau de pureza por cromatografia de afinidade Padronizar as concentrações de antígeno e proteína para testes sorológicos Avaliar a eficiência do novo antígeno no diagnóstico sorológico da LVC Metodologia Diferentes antígenos de Leishmania infantum foram previamente selecionados a partir de rastreamento de uma biblioteca genômica de expressão de Leishmania infantum com base na reatividade de anticorpos usando um conjunto de soros de cães com cultura positiva e pacientes humanos com LV. Vários destes foram avaliados em testes piloto a partir de sua expressão em Escherichia coli em larga escala, com resultados bastante promissores, além de terem sido utilizados como parte de proteínas quiméricas com eficiência aumentada no diagnóstico das LV humana e canina. Dois dos antígenos originais (Lci6 e Lci8), contudo, não foram avaliados adequadamente por falhas na expressão no sistema bacteriano e podem vir a serem opções como alternativas para os testes já desenvolvidos ou para aumentar a eficiência de novas proteínas quiméricas. Genes sintéticos codificando fragmentos representativos das proteínas Lci6 e Lci8 serão clonados em vetor de expressão pRSETa permitindo a sua expressão fusionada a uma cauda poli-histidinas que será usada na sua purificação por cromatografia de afinidade. A expressão das proteínas recombinantes será realizada em Escherichia coli e confirmada por análises de alíquotas das culturas em gel SDS-PAGE, corado com azul de Coomassie R-250. As proteínas serão purificadas por meio de cromatografia de afinidade usando resina (Ni-NTA agarose) após lise bacteriana por ultrasonicação, seguido de novas análises por SDS-PAGE e quantificação. Uma vez otimizada as condições de expressão, o potencial das proteínas investigadas para o seu reconhecimento por soros de indivíduos e cães acometidos pela LV será avaliado por meio da técnica de ELISA. Nesse sentido, serão utilizados soros bem caracterizados de LV canina, bem como soros de indivíduos sadios de área endêmica, provenientes do banco de soros do Instituto Aggeu Magalhães (CEUA /UPE n 03/2020). Antes da realização do teste, será realizada a padronização das concentrações de antígeno, soro e conjugado. O cut off será determinado pela média de leitura do controle negativo somados a duas vezes o desvio-padrão. Os parâmetros de sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo, negativo e intervalo de confiança serão estimados utilizando o programa MedCalc. Os gráficos referentes aos resultados serão construídos através do programa GraphPad Prism.

Bolsista: VINICIUS VERAS E SILVA
Orientador(a): ALOYSIO DA SILVA FERRAO FILHO
Resumo: Os ecossistemas aquáticos vêm sofrendo grande impacto antrópico ao longo das últimas décadas, com a introdução de substâncias de origem diversa, assim como matéria orgânica de origem doméstica e substâncias sintéticas de origem industrial. Isto tem levado a um intenso comprometimento da dinâmica das comunidades naturais, devido ao crescente processo de eutrofização artificial, com consequente aumento na produtividade e alterações na estrutura das comunidades aquáticas, como o aparecimento florações de cianobactérias. Vários gêneros de cianobactérias que formam florações produzem toxinas. As toxinas de cianobactérias, que são conhecidas como cianotoxinas, constituem uma grande fonte de produtos naturais tóxicos produzidos por esses microorganismos. Algumas dessas toxinas, que são caracterizadas como neurotoxinas por sua ação rápida, causam a morte por parada respiratória após poucos minutos de exposição. Outras atuam menos rapidamente e são identificadas como peptídeos ou alcalóides hepatotóxicos. Os microplásticos são outro tipo de problema que vem impactando os ecossistemas aquáticos, tanto de água doce quanto marinhos, podendo se acumular nas cadeias alimentares e causar efeitos no crescimento e na reprodução de organismos aquáticos. O gênero Daphnia, alocado dentro da família Daphnidae (Ordem Cladocera), possui espécies consideradas como sentinelas dos ecossistemas aquáticos de água doce, uma vez que possui uma grande sensibilidade em relação à presença de poluentes. Deste modo, o presente projeto pretende testar o efeito conjunto entre cianobactérias e microplásticos em microcrustáceos filtradores, avaliando o sinergismo dos efeitos prejudiciais de ambos sobre a fisiologia dos organismos testados.

Bolsista: JADE LIZ FERREIRA MENDES SOUZA
Orientador(a): Patricia Sampaio Tavares Veras
Resumo: As leishmanioses são doenças negligenciadas cujos tratamentos incluem a aplicação de antimoniais pentavalentes, anfotericina B, entre outros. Esses tratamentos apresentam limitações como alto custo, tempo prolongado e efeitos colaterais que, em conjunto, evidenciam a necessidade do desenvolvimento de novos fármacos. A proteína de choque térmico 90 (Hsp90), uma chaperona molecular, surge como um alvo quimioterápico para o tratamento da leishmaniose. Estudos do nosso grupo mostraram que inibidores da Hsp90 foram eficazes contra Leishmania spp., em doses não tóxicas para o hospedeiro, in vivo e in vitro. Em estudo ainda não publicado, demonstramos que o tratamento diário, por via intraperitoneal, de camundongos BALB/c infectados por L. braziliensis com 20 mg/kg de 17-DMAG, um inibidor da Hsp90, reduziu a carga parasitária, o diâmetro da lesão e a produção de citocinas proinflamatórias, em comparação ao grupo não tratado. No entanto, os animais tratados apresentaram sinais de toxicidade após seis semanas. Assim, objetivamos produzir e caracterizar nanopartículas poliméricas (NP) de PLGA contendo o 17-DMAG, que permitirão a liberação controlada do fármaco, a redução da dose utilizada e, consequentemente, a diminuição dos efeitos colaterais. A princípio, NP foram produzidas por dois métodos de emulsão dupla (P1 e P2) e caracterizadas morfologicamente por microscopia eletrônica de transmissão (MET) e microscopia eletrônica de varredura (MEV), quanto ao tamanho, formato e aspecto de superfície. O tamanho médio, índice de polidispersão (PdI) e a carga de superfície (potencial zeta - ZP) foram mensurados por Dynamic Light Scattering (DLS), e a eficiência de encapsulamento (%EE) foi medida por cromatografia líquida de alta performance (HPLC). P1 e P2 produziram NP esféricas e de superfície lisa e as NP produzidas por P2 (NP2) apresentaram melhores características que NP1, como menor tamanho (305.5 nm vs 489 nm), menor PdI (0.129 vs 0.33), maior potencial zeta (-28,7 vs -34,4 mV) e maior %EE (15,04% vs 14,9% - análise por sobrenadante - e 17% vs 14.02% - análise por filtro/coluna). Depois, foi avaliada a influência da massa de PLGA (100 ou 200 mg) ou da concentração de PEG (2,5% ou 5%) no tamanho médio e %EE do 17-DMAG nas NP. 100 mg de PLGA produziu NP menores, comparadas àquelas preparadas com 200 mg [336.5 nm (Q1: 318.4; Q2: 349.6) vs 387.8 nm (Q1: 382.8; Q2: 396.7)] e o uso de 5% de PEG gerou NPs menores que o emprego de 2,5% [297.2 nm (Q1: 288.6; Q2:304.1) vs 336.5 nm (Q1: 318.4; Q2: 349.6)]. Também, foram avaliados os perfis de liberação do 17-DMAG das NP otimizadas (NP2-17-DMAG) e a captação de NP por macrófagos derivados de medula óssea (BMMØ). Os resultados mostraram que o 17-DMAG foi liberado continuamente das NP2-17-DMAG ao longo de 72 h. Além disso, foi observado que BMMØ são capazes de captar e manter NPs no citoplasma após 30 min, 1, 2, 4, 6, 24, 48 ou 72 h. Ademais, a citotoxicidade (CC50) de NP2-17-DMAG sobre BMMØ e a eficácia sobre amastigotas intracelulares de L. braziliensis (IC50) foram avaliadas, in vitro. O CC50 de NP2-17-DMAG foi 10,9 vezes menor que o valor de CC50 para o 17-DMAG em sua forma livre [0,294 µM (0,29 ± 0,08) vs 3,2 µM (3,2 ± 1,06), respectivamente]. O IC50 de NP2-17-DMAG foi 3,36 vezes maior que o valor de IC50 para o 17-DMAG em sua forma livre [26,01 nM (26,01 ± 13,59) vs 7,72 nM (Q1: 4,14; Q3: 10,35), respectivamente]. Juntos, os dados mostraram que o encapsulamento do 17-DMAG pelo protocolo NP2 otimizado nesses ensaios, em comparação com o composto livre, aumentou a toxicidade do 17-DMAG sobre BMM? e reduziu sua eficácia no controle da infecção de BMM? por L. braziliensis, in vitro. Para otimizar o efeito leishmanicida com baixa toxicidade, ensaios futuros envolverão a análise, por meio de DSC e FTIR, de possíveis alterações químicas nas NP2-17-DMAG, oriundas de interações entre a NP e o fármaco e buscar por meio de alteração de pH e adição de sais, promover um aumento da %EE do 17-DMAG em NPs.