Revista Eletrônica do Programa de Bolsas - Edição 1

Bolsista: JULIANA APARECIDA VIEIRA DE AMORIM
Orientador(a): Andreimar Martins Soares
Resumo: Os venenos de serpentes são uma combinação de diversas proteínas e enzimas, que possuem ações tanto em presas como em vítimas, onde o principal objetivo é afetar os sistemas fisiológicos vitais de suas presas. Muitas dessas proteínas executam múltiplos papéis importantes, como matar ou imobilizar presas, bem como auxiliar no processo de digestão. Contudo, há décadas que pesquisas vêm transformando algumas dessas toxinas em uma fonte terapêutica. No Brasil, devido à grande biodiversidade, apresenta um vasto campo para bioprospecção de venenos de serpentes, com destaque para os gêneros Bothrops e Crotalus. Levando em consideração, o grande potencial para pesquisa de novas biomoléculas provenientes desses venenos, onde a composição pode ainda ser influenciada por fatores de alimentação, idade da serpente e localização geográfica onde se encontra, é necessário explorar os venenos, com técnicas de isolamento e purificação, juntamente às ferramentas alternativas como a bioinformática, de modo a auxiliar no tratamento de doenças infecciosas e parasitoses como a Leishmaniose. Portanto, o objetivo é investigar a Tripanotiona redutase de Leishmania braziliensis como alvo molecular para prospecção de novos inibidores: Avaliação de componentes ativos da serpente Crotalus durissus com atividade antiparasitária. Metodologias de Bioquímica, Biologia Molecular, Bioinformática, Biotecnologia e Biologia celular serão utilizadas para (i) obter a enzima recombinante tripanotiona redutase (TRLb-Leishmania braziliensis) na forma ativa e elevado grau de pureza; (ii) identificar moléculas de veneno da serpente Crotalus durissus com atividade inibitória sobre a capacidade catalítica da TRLb; (iii) avaliar atividade leishmanicida contra L. amazonensis e L. braziliensis (promastigotas e amastigotas); e (iv) avaliar as interações in vitro e in silico entre o alvo molecular e os inibidores. Por meio do programa Clustal W, temos a sequência do RNA mensageiro identificada de 1475 pb (chromosome: 5; NC_009298.2 LBRM_05_0350), e a correspondente sequência de aminoácidos do alvo a ser expresso (XP_001561849.1; EC 1.8.1.12). A partir da sequência de aminoácidos codificados pela TRLb, será realizado um alinhamento múltiplo com sequências pertencentes a L. panamensis, L. infantum, L. donovani, L. mexicana, L. major, L. brucei e T. cruzi. O processo de síntese e otimização do gene de interesse no vetor de expressão será realizado pela empresa FastBio®. Para obtenção do plasmídeo recombinante, a sequência correspondente a TRLb será inserida no vetor de expressão pET 28(a+) (Novagen®). À sequência será adicionada uma região codificante de polihistidinas (6x) e sítios de restrição para as enzimas NcoI e XhoI. Estas enzimas serão previamente selecionadas após verificação dos sítios de corte na sequência será utilizado o programa Web Cutter®. A propagação do plasmídeo recombinante e transformação bacteriana, por meio de duas cepas de E. coli, sendo uma delas para replicar o plasmídeo (TG1), e a outra para realizar a expressão da enzima [BL21 (DE3)], utilizando choque térmico. A Recuperação do plasmídeo recombinante da TR e quantificação, por meio das células da cepa TG1 de E. coli transformadas com o vetor recombinante pET 28(a+)TRLb para amplificação. Análise da expressão da tripanotiona redutase recombinante utilizando técnica eletroforética e a purificação da enzima recombinante expressa, empregando a cromatografia por afinidade em resina de níquel Ni-NTA (ácido níquelnitrilotriacético) Agarose (QIAGEN®), seguindo as instruções do fabricante. Após isolada a tripanotiona, serão realizados os testes para a avaliação da atividade inibitória, seguindo a ordem: (i) avaliação da atividade enzimática da tripanotiona redutase recombinante utilizando espectrofotômetro Eon Biotek® e o software Gen5®, de acordo com o protocolo de atividade previamente descrito e em colaboração com o Laboratório de Protozoología da Universidade Federal de Santa Catarina e (ii) avaliação da atividade inibitória para frações e/ou toxinas isoladas específicas de venenos de serpente. Para os testes in vitro, serão realizados os ensaios de atividade antipromastigota contra Leishmania amazonenses e Leishmania braziliensis. As formas promastigotas de L. amazonensis (cepa IFLA/BR/67/PH8) e L. braziliensis (cepa MHOM/BR/2014/310), obtidas da Coleção de Leishmania do Instituto Oswaldo Cruz serão mantidas congeladas até o momento do uso no banco da mencionada plataforma.

Bolsista: JADE LIZ FERREIRA MENDES SOUZA
Orientador(a): Patricia Sampaio Tavares Veras
Resumo: As leishmanioses são doenças negligenciadas cujos tratamentos incluem a aplicação de antimoniais pentavalentes, anfotericina B, entre outros. Esses tratamentos apresentam limitações como alto custo, tempo prolongado e efeitos colaterais que, em conjunto, evidenciam a necessidade do desenvolvimento de novos fármacos. A proteína de choque térmico 90 (Hsp90), uma chaperona molecular, surge como um alvo quimioterápico para o tratamento da leishmaniose. Estudos do nosso grupo mostraram que inibidores da Hsp90 foram eficazes contra Leishmania spp., em doses não tóxicas para o hospedeiro, in vivo e in vitro. Em estudo ainda não publicado, demonstramos que o tratamento diário, por via intraperitoneal, de camundongos BALB/c infectados por L. braziliensis com 20 mg/kg de 17-DMAG, um inibidor da Hsp90, reduziu a carga parasitária, o diâmetro da lesão e a produção de citocinas proinflamatórias, em comparação ao grupo não tratado. No entanto, os animais tratados apresentaram sinais de toxicidade após seis semanas. Assim, objetivamos produzir e caracterizar nanopartículas poliméricas (NP) de PLGA contendo o 17-DMAG, que permitirão a liberação controlada do fármaco, a redução da dose utilizada e, consequentemente, a diminuição dos efeitos colaterais. A princípio, NP foram produzidas por dois métodos de emulsão dupla (P1 e P2) e caracterizadas morfologicamente por microscopia eletrônica de transmissão (MET) e microscopia eletrônica de varredura (MEV), quanto ao tamanho, formato e aspecto de superfície. O tamanho médio, índice de polidispersão (PdI) e a carga de superfície (potencial zeta - ZP) foram mensurados por Dynamic Light Scattering (DLS), e a eficiência de encapsulamento (%EE) foi medida por cromatografia líquida de alta performance (HPLC). P1 e P2 produziram NP esféricas e de superfície lisa e as NP produzidas por P2 (NP2) apresentaram melhores características que NP1, como menor tamanho (305.5 nm vs 489 nm), menor PdI (0.129 vs 0.33), maior potencial zeta (-28,7 vs -34,4 mV) e maior %EE (15,04% vs 14,9% - análise por sobrenadante - e 17% vs 14.02% - análise por filtro/coluna). Depois, foi avaliada a influência da massa de PLGA (100 ou 200 mg) ou da concentração de PEG (2,5% ou 5%) no tamanho médio e %EE do 17-DMAG nas NP. 100 mg de PLGA produziu NP menores, comparadas àquelas preparadas com 200 mg [336.5 nm (Q1: 318.4; Q2: 349.6) vs 387.8 nm (Q1: 382.8; Q2: 396.7)] e o uso de 5% de PEG gerou NPs menores que o emprego de 2,5% [297.2 nm (Q1: 288.6; Q2:304.1) vs 336.5 nm (Q1: 318.4; Q2: 349.6)]. Também, foram avaliados os perfis de liberação do 17-DMAG das NP otimizadas (NP2-17-DMAG) e a captação de NP por macrófagos derivados de medula óssea (BMMØ). Os resultados mostraram que o 17-DMAG foi liberado continuamente das NP2-17-DMAG ao longo de 72 h. Além disso, foi observado que BMMØ são capazes de captar e manter NPs no citoplasma após 30 min, 1, 2, 4, 6, 24, 48 ou 72 h. Ademais, a citotoxicidade (CC50) de NP2-17-DMAG sobre BMMØ e a eficácia sobre amastigotas intracelulares de L. braziliensis (IC50) foram avaliadas, in vitro. O CC50 de NP2-17-DMAG foi 10,9 vezes menor que o valor de CC50 para o 17-DMAG em sua forma livre [0,294 µM (0,29 ± 0,08) vs 3,2 µM (3,2 ± 1,06), respectivamente]. O IC50 de NP2-17-DMAG foi 3,36 vezes maior que o valor de IC50 para o 17-DMAG em sua forma livre [26,01 nM (26,01 ± 13,59) vs 7,72 nM (Q1: 4,14; Q3: 10,35), respectivamente]. Juntos, os dados mostraram que o encapsulamento do 17-DMAG pelo protocolo NP2 otimizado nesses ensaios, em comparação com o composto livre, aumentou a toxicidade do 17-DMAG sobre BMM? e reduziu sua eficácia no controle da infecção de BMM? por L. braziliensis, in vitro. Para otimizar o efeito leishmanicida com baixa toxicidade, ensaios futuros envolverão a análise, por meio de DSC e FTIR, de possíveis alterações químicas nas NP2-17-DMAG, oriundas de interações entre a NP e o fármaco e buscar por meio de alteração de pH e adição de sais, promover um aumento da %EE do 17-DMAG em NPs.

Bolsista: MARIA EDUARDA PINTO GONCALVES
Orientador(a): GEOVANE DIAS LOPES
Resumo: Este projeto propõe mapear as proteases de superfície da membrana plasmática de Leishmania spp. Essas enzimas são fatores de virulência relevantes e fazem parte dos componentes de superfície celular que atuam nos primeiros contatos do parasito com o hospedeiro. Diversas funções biológicas das proteases já foram descritas, porém há inúmeras lacunas sobre as classes e a quantidade destas enzimas na superfície do parasito. Nossa hipótese é que a utilização de um biossensor de refletância para detecção de proteínas na superfície da membrana plasmática é uma excelente ferramenta para a compreensão da expressão regulada destes componentes de superfície. Este projeto vai agregar conhecimentos estratégicos sobre as proteases que compõe a membrana de L. (V.) braziliensis e L. (L.) amazonensis indicando uma ampla possibilidade de ações destas enzimas no ciclo de vida do parasito e sua importância na adaptação aos seus respectivos hospedeiros. Por fim, a padronização deste modelo de membrana será útil em diversos ensaios de interação com alta sensibilidade, especificidade e reprodutibilidade da técnica para detecção das diferenças na membrana plasmática de diferentes espécies de Leishmania.

Bolsista: Luisa Mendonça Gregório
Orientador(a): DANIELA DE MELO RESENDE
Resumo: As leishmanioses são doenças causadas por protozoários da ordem Kinetoplastida, família Trypanosomatidae, do gênero Leishmania e são de grande importância na saúde pública mundial. A transmissão da infecção para os hospedeiros vertebrados ocorre através da picada de fêmeas de flebotomíneos infectadas, existindo duas principais formas clínicas da doença, a leishmaniose tegumentar e a leishmaniose visceral. Atualmente, não há vacina disponível e o tratamento é feito, principalmente, por fármacos que apresentam problemas como alta toxicidade, falha terapêutica em infecção por parasitos resistentes e elevado custo. O trabalho em desenvolvimento tem como objetivo estudar genes diferencialmente expressos associados à resistência. Para isso, através do perfil transcriptômico de Leishmania infantum, foram identificados genes de diferentes vias metabólicas associados ao fenótipo de resistência ao antimônio. A partir desse conjunto de dados, a primeira proteína selecionada para estudo neste trabalho foi a Dual Specificity Protein Phosphatase (DUSP). Essa proteína é capaz de desfosforilar resíduos de fosfotirosina e fosfoserina/treonina ao mesmo tempo em um único substrato, atuando no controle de respostas imunes inflamatórias e antimicrobianas, especialmente contra infecção por Leishmania donovani e Leishmania mexicana. Com isso, a DUSP se tornou uma proteína alvo terapêutica promissora para a busca de fármacos para o tratamento da leishmaniose visceral através da estratégia de reposicionamento de fármacos, que é utilizada para obter fármacos em desenvolvimento ou já disponíveis no mercado com potencial para utilizar no tratamento da doença. Para as análises computacionais foi utilizado o TriTrypDB, uma plataforma que fornece um conjunto de dados a nível de escala genômica de Trypanosomatidae. Através do identificador LINF_340027100, foi possível obter para a espécie em estudo, Leishmania infantum, a sequência da proteína predita com 1.382 nucleotídeos e por meio do tBLASTn foi feita a análise de busca por similaridade de sequências contra o genoma de L. infantum com o objetivo de identificar cópias não anotadas do gene, o que não foi observado. Além disso, foi possível observar a ontologia do gene para o gênero Leishmania utilizando o vocabulário controlado Gene Ontology. Foram feitas análises de alinhamento múltiplo global com o programa Clustal Omega para verificar a similaridade entre a sequência estudada e seus homólogos em outras espécies de Leishmania disponíveis no banco de dados, e foi possível observar um alto grau de similaridade entre as proteínas estudadas. Ademais, através da função de predição, foi permitido analisar todos os processos biológicos que envolvem a proteína no parasito, além das interações com outras vias metabólicas. Por meio de todo esse estudo, foi possível utilizar o DRUGBANK para buscar fármacos em potencial para reposicionamento. Nessa análise, foram identificados 107 matches e uma interação com a droga Fostamatinib. Com isso, serão necessários maiores estudos sobre o fármaco selecionado, uma vez que a Fostamatinib é o primeiro inibidor específico da tirosina quinase no baço aprovado para o tratamento da trombocitopenia imune crônica, uma doença caracterizada pela diminuição do número de plaquetas circulantes no sangue devido à destruição delas pelo sistema imune. Além disso, a administração é realizada por via oral e é aprovada para uso no Brasil, sendo possível dar continuidade aos estudos in vitro.

Bolsista: SABRINA GOMES RODRIGUES
Orientador(a): CLAUDIA REGINA BRANDAO GOMES
Resumo: A tuberculose (TB) é uma doença causada pelo Mycobacterium tuberculosis, e representa um grave problema de saúde pública, apesar da existência de um esquema terapêutico que, na maioria dos casos, leva a cura. De acordo com dados da Organização Mundial de Saúde (OMS), cerca de um terço da população mundial é portadora assintomática do M. tuberculosis, e a estimativa é que em 2019, cerca de 10 milhões de novos casos de TB ocorreram em todo o mundo e, aproximadamente 1,2 milhões de pessoas morreram da doença. No mesmo ano, a estimativa é que meio milhão de pessoas desenvolveram tuberculose resistente a rifampicina, dentre elas, 78% tinham tuberculose multirresistente. No Brasil, segundo dados oficiais do Ministério da Saúde, em 2019 foram notificados 66.819 novos casos de TB (incidência de 31,6/100 mil habitantes). Neste ano, foram notificados cerca de 4,5 mil óbitos pela doença, com um coeficiente de mortalidade de 2,2 óbitos por 100 mil habitantes. Diante deste panorama, torna-se urgente o desenvolvimento de novas substâncias potencialmente ativas, capazes de apresentar maior eficácia e baixa resistência. Dentre as moléculas propostas para a síntese de novas substâncias com potencial atividade antituberculose pode-se destacar os derivados quinolínicos. Vários derivados quinolínicos tem sido reportado na literatura com atividade antituberculose, podendo-se destacar a bedaquilina, um derivado diarilquinolínico, que foi aprovado em 2012 pelo FDA, e em 2019 pela ANVISA. A bedaquilina é eficaz no tratamento de pacientes com infecção pulmonar por Mycobacterium tuberculosis multirresistente e extensivamente resistente a múltiplos fármacos. Neste contexto, o nosso grupo vem trabalhando com a síntese de várias substâncias desta classe, sendo o objetivo deste trabalho a síntese e o aumento de escala de building-blocks que possibilitem a obtenção de uma biblioteca de substâncias derivadas do núcleo 7-cloroquinolina, com múltiplos padrões de substituição na posição C-6, e funcionalizados na posição C-4 com as porções etilenodiamina, hidrazina e etanolamina.

Bolsista: VITOR GAMA VIEIRA DE ARAUJO REGIS
Orientador(a): Zulma Maria de Medeiros
Resumo: PROJETO DE PESQUISA Diagnóstico e prevenção de letalidade por leishmaniose visceral em pessoas coinfectadas com HIV em Gravatá – Pernambuco. JUSTIFICATIVA E RELEVÂNCIA A leishmaniose visceral (LV) é uma parasitose com predomínio de casos nas regiões tropicais e subtropicais7. Apesar de endêmica em mais de 60 países, sete países respondem por mais de 90% do número de casos – Brasil, Etiópia, Índia, Quênia, Somália, Sudão do Sul e Sudão1. Nas Américas, 97% dos casos ocorrem no Brasil8. A coinfecção da LV e do vírus da imunodeficiência humana (LV/HIV) é um importante problema de saúde pública, poia o HIV+ eleva o risco de desenvolver LV em 100 a 2.320 vezes3 e o HIV+ aumenta o risco de recidiva de LV6. A prevalência de LV/HIV no Brasil varia de acordo com a região e com o método diagnóstico empregado. Um estudo realizado pelo nosso grupo de pesquisa em Pernambuco no qual teve como critério para definir LV/HIV foi ter ao menos um teste positivo para LV, foi observada uma prevalência de 16,91%3. As manifestações clínicas da LV/HIV podem ser perda de peso, febre, esplenomegalia e hepatomegalia, mas são sintomas mais frequentes nos casos de LV2, fato que pode retardar o diagnóstico de LV/HIV4. Além disso, os testes sorológicos tendem a ser menos sensíveis em pessoas imunocomprometidas9, e nenhum método atualmente disponível apresenta sensibilidade e especificidade altas no LV/HIV, sendo sugerida a associação de diferentes métodos para um diagnóstico mais preciso5. Já que o tratamento em pacientes com coinfecção tem maior risco de falha5, o diagnóstico precoce é de suma importância para reduzir a mortalidade2. OBJETIVOS Geral Desenvolver estratégias para diagnóstico e prevenção de letalidade por leishmaniose visceral em pessoas LV/HIV em Gravatá - Pernambuco. Específicos Identificar casos LV/HIV através de testes imunológicos e moleculares mapear os casos na rede de atenção à saúde como estratégia de vigilância no município. METODOLOGIA O estudo será realizado no Serviços de Assistência Especializada em HIV/aids (SAE/SUS), em Gravatá. A população do estudo será pessoas HIV+, de ambos os sexos e com idade > de 18 anos. Um estudo transversal serão realizados com exames clínicos e laboratoriais para confirmação do diagnóstico de LV/HIV, quando pelos menos um dos testes forem positivos: rK39-ICT, DAT, KAtex e PCR convencional. Além disso, serão coletadas informações, entrevista, prontuário e exame físico: o tratamento ao HIV, LV passadas ou recorrentes, medicamentos para HIV e exames laboratoriais (hemograma, as enzimas hepáticas, a função hepática, a função renal, a contagem de globulinas e a carga viral, CD8+, CD38+ e CD4). O projeto foi aprovado pelo comitê de ética em pesquisa (CAEE 38488020.9.0000.5190). CRONOGRAMA Atividades/Meses da bolsa 1. Preparação de cartilha convite aos pacientes – Mês 1 2. Seleção dos pacientes – Meses 1-2 3. Coleta de informações – Meses 2-4 4. Coleta de amostras biológicas – Meses 3-5 5. Processamento das amostras biológicas – Meses 3-6 6. Análise dos dados – Meses 5-8 7. Mapeamento dos casos de coinfecção LV/HIV – Meses 7-9 8. Liberação dos laudos aos pacientes – Meses 5-10 9. Confecção dos relatórios – Meses 10-11 BIBLIOGRAFIA 1. BURZA, S et al. The Lancet, v. 392, n. 10151, p. 951–970, 2018. 2. COUTINHO, JVSC et al. R da Rev Soc Bras Med Trop, v. 50, p. 670-674, 2017. 3. GUEDES, DL et al. Am. J. Trop. Med. Hyg, [s. l.], v. 99, n. 6, p. 1541–1546, 2018. 4. HENN, GAL et al. braz j infect dis., [s. l.], v. 22, n. 2, p. 92–98, 2018. 5. LINDOSO, JAL et al. Hiv/aids, v. 10, p. 193, 2018. 6. LIRA, JLM; CALADO, MF; DE LUCENA OLIVEIRA, L. Res., Soc. Dev, v. 9, n. 10, p. e7249109203-e7249109203, 2020. 7. ORGANIZAÇÃO MUNDIAL DA SAÚDE (OMS). Leishmaniasis. [S. l.], 2018. 8. ORGANIZAÇÃO PAN-AMERICANA DA SAÚDE (OPAS). Leishmanioses: Informe epidemiológico nas Américas. [s. l.], v. 9, 2020. 9. VAN GRIENSVEN, J; DIRO, E. Inf Dis Clin North America J, [s. l.], v. 33, n. 1, p. 79–99, 2019.