Revista Eletrônica do Programa de Bolsas - Edição 2

Bolsista: LARISSA APARECIDA PEREIRA SOUSA
Orientador(a): LUCIANE ALMEIDA AMADO LEON
Resumo: Considerando o cenário atual do COVID-19, com surgimento de variantes preocupantes (VOCs) de SARS-CoV-2, que alertam para novas ondas de transmissão e potencial aumento da patogenicidade, destacamos a importancia de continuar pesquisando as características basais e os desfechos desta doença para viabilizar o desenvolvimento de tratamentos e vacinas eficazes. Portanto, estudar perfis de expressão gênica pode ser uma alternativa para a melhor compreensão dos processos biológicos envolvidos na COVID-19, buscando entender as possíveis diferenças entre pacientes que resolvem a infecção de forma rápida e eficaz, e aqueles que desenvolvem quadros clínicos mais graves e, eventualmente, evoluem a óbito. MicroRNAs (miRNAs) são moléculas de RNA fita simples que não codificam proteínas, que estão relacionadas à regulação gênica a nível pós-transcricional, provocando a degradação do RNA mensageiro (mRNA) ou inibindo a tradução de proteínas. A alta estabilidade dessas moléculas em diversos tecidos, incluindo plasma e soro, facilita sua eficiente utilização como biomarcadores não invasivos para uma variedade de doenças. Desta forma, os miRNAs podem ser potenciais biomarcadores pra COVID-19, visto que há a possibilidade de monitorar a progressão clínica da COVID-19, auxiliando na estratégia de manejo e prognóstico de cada indivíduo. O Objetivo principal deste estudo é avaliar a associação de miRNAs séricos com parâmetros clínicos e desfechos na COVID-19, a fim de identificar seu potencial como biomarcadores não invasivos de gravidade e mortalidade na COVID-19. Para isso, serão incluídos no estudo indivíduos internados no Hospital Universitário Clementino Fraga Filho – UFRJ (HUCFF) com infecção por SARS-CoV-2 confirmada laboratorialmente, que foram classificados em não grave (n=67) e grave (n=39), para comparações de dados clínicos, sociodemográficos e laboratoriais. Indivíduos sem COVID-19 doadores de sangue, provenientes do HEMORIO serão incluídos no estudo como grupo-controle. Todos os pacientes foram acompanhados durante o período de internação até o desfecho (alta ou óbito) e os dados sociodemográficos, de evolução clínica e laboratorial foram obtidos por meio de consulta aos prontuários. Será realizada a padronização das técnicas de detecção de miRNA em soro, utilizando os controles exógenos (cel-mir-39 e mir-54-5p) e o controle endógeno (U6) para validar a padronização. Inicialmente o RNA total será extraído com o kit mirVana PARIS RNA, porém serão avaliados diferentes volumes de eluição final. Posteriormente, a quantificação e avaliação da qualidade do RNA extraído será feita por espectrofotômetro. Em seguida, será realizada a síntese de cDNA utilizando-se o kit Taqman miRNA Reverse Transcription (Applied Biosystem) e miRNA-specific (steam loop RT primers) para os controles (cel-mir-39, mir-54-5p e U6). Para avaliação da expressão de miRNAs dos controles exogeno e endógeno, as reações de RT-qPCR serão realizadas em duplicata utilizando Taqman Universal PCR Master Mix e primers especificos. A partir dos resultados da padronização, será realizada a validação da expressão gênica por RT-qPCR, de miRNAs pre-selecionados com perfil de expressão significativamente diferente entre pools de amostras constituídos por COVID-19 grave e não grave. Os alvos de miRNAs que tiverem sua expressão gênica validada, serão avaliados posteriormente em todos os indivíduos do estudo classificados com COVID-19 grave, COVID-19 não grave, e negativos para SARS-CoV-2, a fim de investigar seus potenciais como biomarcadores. Para a expressão gênica de alvos individuais de miRNAs será utilizado o sistema TaqMan de RT-qPCR, no equipamento Quantstudio 3, na Plataforma de PCR em Tempo Real da Fiocruz, com o método do Ct comparativo (ddCt). Com esse estudo pretende-se identificar biomarcadores de miRNA associados à diferentes manifestações clínicas e desfechos, que podem ser futuramente aplicados em testes prognósticos e investigados como potenciais alvos terapêuticos.

Bolsista: Laura de Azeredo Santos
Orientador(a): Marcio Sacramento de Oliveira
Resumo: A dengue é uma doença febril aguda, sistêmica, dinâmica, debilitante e autolimitada, causada por vírus transmitido aos humanos pelas picadas de mosquitos fêmeas infectados. No Brasil, a primeira epidemia documentada clínica e laboratorialmente ocorreu em 1981-1982, em Boa Vista (RR), causada pelos sorotipos 1 e 4. Após quatro anos, em 1986, ocorreram epidemias atingindo o estado do Rio de Janeiro e algumas capitais da região Nordeste. Desde então, a dengue vem ocorrendo de forma continuada (endêmica), intercalando-se com a ocorrência de epidemias, geralmente associadas à introdução de novos sorotipos em áreas indenes (sem transmissão) e/ou alteração do sorotipo predominante, acompanhando a expansão do mosquito vetor. Até a primeira semana de abril de 2024, foram notificados no país 2.747.643 casos de dengue, 1078 óbitos confirmados e 1593 em investigação. Diante do quadro epidemiológico da dengue, sobretudo no Brasil e, devido ao cenário de crise econômica que o país passa nos últimos anos e a atual crise sanitária afetando os investimentos em PD&I, definir prioridades de investimento e priorizar políticas realmente efetivas, se faz necessária a realização de estudos prospectivos direcionados a atender demandas específicas. O projeto tem por objetivo analisar a produção científica e tecnológica global sobre a dengue. A metodologia consiste na recuperação de registros em dengue, sobre a perspectiva da Vigilância em Saúde, nas bases Web of Science, PubMed e Scopus para produção científica e no Orbit Intelligence para produção tecnológica, no período de 2010 a 2024. Através das técnicas de text e data mining será desenvolvida uma base de dados organizada e estruturada para a realização de análise bibliométrica. Serão utilizados os softwares Vantagepoint (Marca Registrada) e VOSviewer para as etapas de tratamento e de análise dos dados.

Bolsista: ANA LUIZA SOARES CHAVES
Orientador(a): Isabela Penna Ceravolo
Resumo: A determinação da atividade de potenciais antimaláricos in vivo é realizada no modelo murino, onde é possível se avaliar o metabolismo, a farmacocinética e as propriedades físicas preditivas de uma terapia oral. O padrão ouro utilizado para avaliação da atividade de drogas em camundongos experimentalmente infectados com Plasmodium é a contagem da parasitemia em esfregaços corados por microscopia óptica. No entanto, esse processo é demorado, requer técnicos experientes e não é automatizado. Portanto, a padronização de um método que utilize fluorescência como forma de substituir a contagem em microscópio apresenta vantagens como: (i) maior rapidez na triagem de potenciais antimaláricos, e a (ii) diminuição de resultados inconsistentes que podem ser influenciados por fatores humanos. O objetivo do presente trabalho foi otimizar um ensaio baseado na fluorescência do fluoróforo SYBR Green I (SYBRG), que é um intercalante de DNA, como descrito anteriormente (Arias et al. 2016), onde a fluorescência se apresenta diretamente proporcional à carga parasitária e inversamente proporcional a ação da droga-teste. Para isso, utilizamos camundongos suíços infectados experimentalmente com a cepa NK65 de Plasmodium berghei, em um inóculo de 107 hemácias infectadas. O tratamento com antimaláricos padrões foi realizado no 2°, 3° e 4° dia após a infecção, e a retirada do sangue pela porção final da cauda dos animais para ser incubado com SYBR green I (SYBRG), ou para a realização de esfregaços foi feita no 5° dia. Para testar o limite de sensibilidade do teste de fluorescência, utilizamos inicialmente o antimalárico cloroquina, e, posteriormente, o artesunato, já que a detecção de parasitemias apenas superiores a 1,4% (Arias et al. 2017) seria uma grande limitação caso tivéssemos amostras que apresentasse parasitemias baixas como aquelas encontradas em drogas ativas como os antimaláricos. Sob as nossas condições, que foi a utilização de sangue total, a diluição de SYBRG em tampão de lise, e a posterior incubação por 1 h à temperatura ambiente e sob abrigo da luz, houve a diferenciação de 1,38 a 4,35x entre a fluorescência de amostras de sangue de animais normais e infectados com o P. berghei nos cinco diferentes ensaios já realizados. Para testar a sensibilidade do teste foram realizadas três diferentes curvas de cloroquina, em doses que variaram de 1,25 a 10 mg/Kg. Os valores de r2 do coeficiente de Pearson dos três ensaios foram de 0,8918, 0,8916 e 0,9302 o que representa uma correlação forte e muito forte entre as técnicas de fluorescência e microscopia. Já nas duas curvas de artesunato realizadas, o valor de r2 referente ao coeficiente de Pearson foi de 0,9486 e 0,9785, correspondendo a uma correlação muito forte entre as duas técnicas realizadas. Nosso próximo passo será testar outros antimaláricos, além de extratos de plantas e compostos sintéticos e comparar os resultados obtidos na fluorescência com aqueles obtidos no teste supressivo de Peters (1965), que é o padrão ouro para avaliação de potenciais antimaláricos em camundongos experimentalmente infectados. Financiado pelo PIBIC/CNPq/FIOCRUZ, CNPq, FAPEMIG e IRR.

Bolsista: JULIA DUTRA VAZ
Orientador(a): ARTHUR DANIEL ROCHA ALVES
Resumo: O Parvovirus B19 (B19V) tem um pequeno genoma DNA fita simples, com aproximadamente 5600 nucleotídeos, e está associado com uma ampla gama de manifestações clínicas, como: eritema infeccioso, hidropsia fetal, anemia severa ou crise aplástica transitória. Embora tenha um genoma altamente conservado, em mais de 80% entre os isolados, o B19V apresenta três genótipos (1, 2 e 3) que pode ser acessado via sequenciamento do DNA do B19V em amostras clínicas, levando a um rastreamento epidemiológico mais preciso. A variabilidade genética de B19V encontrada em um estudo piloto demonstrou a ocorrência de quasispecies na população de estudo avaliada. Em gestantes, mesmo imunocompetentes, a infecção pelo B19V pode resultar em hidropsia e óbito fetal, consequentes de anemia grave. Desta forma, o objetivo do estudo é avaliar a variabilidade genética de isolados de B19V em gestantes e correlacionar com diferentes manifestações clínicas e patológicas deste vírus. Para a determinação do genótipo, avaliação de variabilidades genéticas do B19V e a possível ocorrência de quasispecies, será realizada a amplificação do segmento genômico entre os nucleotídeos 2210-3342 (região VP1-VP2 do B19V) obtido por PCR convencional. Os produtos de PCR purificados e quantificados serão submetidos ao sequenciamento do genoma completo através da técnica de sequenciamento de nova geração (NGS). Com este estudo pretendemos demonstrar a relevância desse vírus em termos epidemiológicos e a possível implicação de variantes virais em diferentes manifestações clínicas e desfechos heterogêneos em gestantes infectadas com B19V

Bolsista: GABRIELLE LEAL RODRIGUES MONTEIRO DOS SANTOS
Orientador(a): LETICIA DA CUNHA GUIDA
Resumo: A Síndrome de Prader-Willi (SPW) é uma doença genética complexa, multissistêmica, caracterizada por anormalidades endócrinas, neurológicas e mentais. A síndrome ocorre em cerca de 1 para 15.000 nascidos vivos e se caracteriza por uma fase neonatal acometida por hipotonia severa associada à dificuldade de sugar, com choro fraco e pouca atividade. Seu desenvolvimento neuro-motor é lento, tardam a sentar, engatinhar e caminhar. O período adulto é caracterizado por hiperfagia e severa obesidade, baixa estatura, hipogonadismo, características faciais, escoliose e um comportamento compulsivo-obsessivo. A SPW ocorre pela perda de função de genes localizados no cromossomo 15q11-13. Aproximadamente 70% dos indivíduos com a síndrome tem uma deleção na região 15q11.2-q13 no cromossomo herdado do pai, enquanto 25% tem uma dissomia uniparental materna, 5% tem uma alteração na sequência do centro de imprinting (IC), e menos de 1% tem um rearranjo estrutural cromossômico envolvendo a região 15q11.2-13. O uso de hormônio de crescimento (hrGH) nessas crianças tem por objetivo primário a mudança da composição corpórea e a melhora da atividade física e da qualidade de vida. Por outro lado, muitos pacientes com SPW são, de fato, deficientes em GH, ocorrendo melhora no padrão de crescimento com o tratamento. Vários estudos mostram que um diagnóstico precoce, antes da manifestação dos sintomas, principalmente antes da obesidade, tem trazido uma melhora na qualidade de vida dos portadores da SPW nos últimos anos. O processo de diagnóstico da SPW é baseado em um conjunto de técnicas moleculares que além de diagnosticar a doença, irá apontar o mecanismo responsável por ela. Várias são as técnicas que identificam as deleções como por exemplo FISH e MLPA. Porém nenhuma técnica consegue distinguir as dissomias dos defeitos do IC, sendo necessária a análise de microssatélite para identificar as dissomias. Essa identificação é muito relevante para o aconselhamento genético dessas famílias quanto ao risco de recorrência uma vez que as mutações no IC levam à um risco de recorrência de 50%. O trabalho tem como objetivo desenvolver uma análise por microssatélites do cromossomo 15 através da análise da Curva de Dissociação em Alta Resolução (HRM) para identificar os casos de dissomia uniparental nos indivíduos com a síndrome de Prader-Willi.

Bolsista: YASMIN DUMAS INDRELE
Orientador(a): Hellen Geremias dos Santos
Resumo: A dengue caracteriza-se por uma doença febril aguda, transmitida pela picada do mosquito fêmea Aedes Aegypti, infectado por um dos quatro sorotipos do vírus causador da doença (DENV-1, DENV- 2, DENV-3 e DENV-4). Os casos de dengue no Brasil somaram 899,5 mil até abril de 2023, valor 30% superior ao observado para 2022 no mesmo período. O Paraná é, atualmente, um dos estados brasileiros mais afetados por essa doença. Este ano, sobretudo na região norte e oeste do Estado, serviços de saúde enfrentaram dificuldades para atender a alta demanda devido à dengue. Modelos preditivos de casos de dengue podem ser utilizados como alertas para o aumento de casos, a partir da tendência observada para características climáticas, histórico da transmissão, entre outras informações, como dados passados de internações e óbitos pela doença. O presente trabalho objetiva predizer o número de casos de dengue para um horizonte de tempo de 3 meses para Regionais de Saúde do estado do Paraná que apresentem maior incidência para a doença. Para tanto, iremos caracterizar o perfil epidemiológico da dengue para as 22 Regionais de Saúde do Estado do Paraná, por meio de análise de tendência mensal do número de casos e da taxa de incidência da doença para o período de 2012 a 2022; identificar, para cada Macrorregião do Estado, Regionais de Saúde com maior incidência para a doença; realizar análise descritiva e calcular indicadores de saúde relacionados a dados de clima, infraestrutura urbana e social, casos notificados de outras arboviroses (Zika e chikungunya) e internações e óbitos por dengue clássico ou febre hemorrágica da dengue; avaliar a correlação de indicadores de saúde com a incidência de dengue e, então, predizer o número de casos de dengue para as Regionais de saúde e os municípios com maior incidência da doença, utilizando algoritmos baseados em árvore de regressão. Dados de diferentes Sistemas de Informações em Saúde serão explorados (Sistema de Informação sobre Agravos de Notificação – SINAN, Sistema de Informações sobre Mortalidade – SIM, Sistema de Informações Hospitalares do Sistema Único de Saúde – SIH-SUS), bem como dados socioeconômicos e demográficos do Censo de 2010, dados climáticos do Instituto Nacional de Meteorologia (INMET), e correspondentes a recursos físicos e humanos de serviços de saúde, disponíveis no Cadastro Nacional de Estabelecimentos de Saúde (CNES). A variável resposta será representada por de casos de dengue para os 399 municípios do Estado do Paraná obtidos do SINAN para o período de 2012 a 2022. Na etapa de predição, os dados serão organizados para a avaliação de modelos preditivos do número de casos novos de dengue para um horizonte de tempo de 3 meses. Os preditores serão representados pelos seguintes indicadores: número mensal de casos notificados de Zika e chikungunya, e de internações e óbitos por dengue clássico ou febre hemorrágica devido ao vírus da dengue, número de Equipes de Saúde da Família (ESF) e de leitos hospitalares a cada 10.000 habitantes, densidade do município, densidade domiciliar, proporção de residentes em área urbana, proporção de residentes em favela, proporção de residentes com coleta de lixo, Produto Interno Bruto per capita anual, expectativa de vida ao nascer, média mensal de temperatura, precipitação e umidade. Parte dos dados será utilizada para o treinamento do modelo preditivo (conjunto de treinamento) e parta para a avaliação do modelo ajustado (conjunto de teste). Nesta pesquisa serão avaliados os seguintes modelos baseados em árvores de regressão: Random Forest e Gradiente Boosted Trees. A avaliação da performance dos modelos no conjunto de teste será realizada a partir do cálculo das seguintes métricas: Erro Absoluto Médio, Raiz do Erro Quadrático Médio e Coeficiente de determinação. O processamento e análise dos dados serão realizados com auxílio dos programas R e Python.